農桿菌介導法轉化小麥的研究進展

楊麗娟，盛 坤，蔣志凱，劉朝輝，趙宗武

（新鄉市農業科學院，河南 新鄉 453000）

農桿菌介導法轉化小麥的研究進展

楊麗娟，盛 坤，蔣志凱，劉朝輝，趙宗武

（新鄉市農業科學院，河南 新鄉 453000）

農桿菌介導法具有操作簡便、成本低、實用性強等諸多優點，廣泛應用于小麥遺傳轉化。綜述了農桿菌介導法轉化小麥的敏感基因型篩選、外植體類型選擇及轉化體系優化方面的研究進展，對農桿菌介導法轉化小麥前景進行了展望。

農桿菌；遺傳轉化；小麥

小麥是重要的糧食作物，利用植物基因工程技術進行小麥遺傳改良，增強小麥抗病蟲和耐逆境能力，提高產量，改善品質，是小麥遺傳育種的研究方向之一。當前，用于小麥遺傳轉化的手段主要有基因槍法、農桿菌介導法和花粉管通道法。農桿菌轉化法具有基因拷貝數低、轉基因沉默相對較少、轉移的基因片段較長、轉化效率高等優點（徐春暉等，2002）。根癌農桿菌在土壤中含量極其豐富，能在植物組織中生長。農桿菌介導法是目前應用最為廣泛的植物轉化方法。

伴隨著農桿菌介導的粳稻遺傳轉化體系日趨成熟，單子葉植物目前也能夠用這種方法進行轉化（Hamid等， 1994； Ye等， 2000）。農桿菌介導的轉基因方法具有操作簡單、成本低，受體范圍廣等特點，但農桿菌介導法也存在一定不足，如易受基因型特異性，宿主范圍的限制，再生細胞感受態與轉化細胞感受態不一致性和易導致檢測結果假陽性等，農桿菌介導法轉化小麥有待于建立并完善其高效轉化體系。

1 敏感基因型篩選

小麥高頻再生系統是提高轉化率的首要保證，其中受體基因型是影響轉化率的重要因素。不同小麥基因型對農桿菌侵染的敏感程度不同，篩選對農桿菌敏感的小麥基因型對于小麥新品種選育和功能基因組研究具有重要意義。優良小麥品種成熟胚再生性能和農桿菌敏感性評價為進一步利用細胞工程和基因工程途徑改良小麥奠定了基礎。

Bobwhite是常用的基因型（楊云霞，2005；王艷麗2006；衣大龍，2009）。王艷麗等（2005）利用含GUS基因的C58C1農桿菌菌系轉化83個小麥基因型的幼穗，發現CA9924、北農49、西農2611、京冬11等基因型幼穗對農桿菌侵染比較敏感；但農桿菌侵染后小麥幼穗切段僅僅不斷膨大，幾乎不產生愈傷組織，難以獲得再生植株。張彬（2006）等人以3個栽培冬小麥品種運豐優、臨優145、中優9507的成熟胚愈傷組織為外植體研究發現，三種小麥基因型對根癌農桿菌的敏感性存在顯著差異，以臨優145最敏感。后猛（2008）以100份普通小麥品種（系）和4份二倍體及四倍體小麥為實驗材料，進行成熟胚愈傷組織誘導及分化再生的研究，篩選出了愈傷組織出愈率高、愈組質量好、分化能力強、成苗率高的山農2618等多個優良基因型材料。陶麗莉（2009）根據農桿菌侵染后胚性愈傷組織誘導率和抗性植株再生率，從41個小麥品種中篩選到了比較適合農桿菌介導遺傳轉化的CB037、06SKW28、邯6172、豫麥66、新春9號、輪選987、CA8694等基因型，其胚性愈傷組織誘導率都在10.0%以上，抗性植株再生率均高于2.0%。李欣（2012）等研究了12個優良小麥新品種成熟胚再生率及其對農桿菌侵染的敏感性，認為周麥27、揚麥19等品種適合進行成熟胚培養，周麥18、揚麥15等品種成熟胚適合進行農桿菌轉化。楊賽奇（2012）初步根據幼胚愈傷組織的組培特性對黃淮麥區95種主流普通小麥栽培品種進行聚類分析，將所有基因型劃分成7個類群，不同小麥基因型對農桿菌侵染的敏感程度不同，其中有一個類群有較好的組培特性。

2 外植體類型選擇

許多外植體都被嘗試用于小麥組織培養再生體系，包括幼胚、成熟胚、盾片、幼穗、幼葉、分生組織、根尖等。截至目前，小麥幼胚是農桿菌介導法轉化小麥的常用外植體，高效離體再生體系的建立是小麥遺傳轉化的關鍵所在，外植體選擇是重要環節。小麥幼胚培養力高、植株再生能力強，被認為是最理想的外植體材料，但小麥幼胚的取材受季節嚴格限制，而且存在著基因型單一、轉化效率不穩定等缺點，并且農桿菌侵染后導致小麥幼胚愈傷組織褐化死亡現象嚴重，一定程度制約了小麥基因工程育種和功能基因組研究的深入。

小麥成熟胚取材方便，不受季節、環境條件和植株發育狀況等因素的限制，個體間生理狀態一致，是開展小麥遺傳轉化較為方便的外植體。但是，小麥成熟胚植株再生率非常低，限制了成熟胚在小麥遺傳轉化中的應用。但目前已有許多農桿菌轉化成熟胚的成功嘗試（Khurana等，2002； Patnaik等，2006； Ding等， 2009； Wang等， 2009）。

許多研究者用幼穗和花藥作為農桿菌轉化的外植體并獲得了成功。高春生（2006）等研究了在不同誘導和分化條件下幼穗愈傷組織誘導再生頻率及其差異，結果表明中部穗段是最好的外植體。陳梁鴻等（1999）利用基因槍轉化小麥幼穗愈傷組織，將EPSPS基因轉入了小麥，獲得了轉基因植株。趙愛菊等（2011）采用農桿菌介導法對小麥花藥愈傷組織進行轉化，結果表明不同基因型的花藥培養力存在顯著差異，其中小麥品種石4185和冀5265是小麥花藥農桿菌轉化的良好受體基因型。張艷敏等（2003）以石4185、石6365的花藥愈傷組織為受體，進行了甜菜堿醛脫氫酶和膽堿氧化物酶等目的基因的轉化，PCR檢測到陽性抗性再生植株。Amoah等（2001）利用農桿菌侵染小麥幼穗，研究了影響GUS基因在幼穗中表達的因素，但最終沒有獲得轉基因植株。黃益洪等（2002）分別以小麥幼穗和花藥為受體材料，利用不同農桿菌菌株感染，發現農桿菌菌系、小麥基因型和外植體對轉化效果均有影響，幼穗侵染后GUS基因瞬時表達率高于花藥。

多人研究結果表明農桿菌可以侵染小麥植株（Hess等，1990； Mooney等， 1991；Langridge等，1992）。何道一等（2003）首次報道利用小麥開花期農桿菌滴入小花的方法獲得了轉基因小麥植株。Zale等（2009）在小麥孕穗期將穗子從葉鞘中剝出，在農桿菌菌液中浸泡1～2min，下一代經巴龍霉素篩選和PCR、Southern檢測，證明獲得了轉基因植株。

Razzaq等（2005）將萌芽的小麥種子剝去胚芽鞘，暴露生長點，細針刺傷生長點后利用農桿菌侵染，獲得了陽性植株。Supartana等（2006）將小麥種子在水中浸泡1d，用蘸有農桿菌的細針穿刺芽尖部位，2d后滅菌和春化處理，Southern雜交鑒定出5個農藝性狀表現差異的轉基因株系。Zhao等（2006）以小麥莖尖為受體，獲得了帶有β-1，3-葡聚糖酶基因的抗白粉病植株。梁欣欣等（2007）利用農桿菌感染小麥幼苗莖尖，經在含有除草劑的培養基上篩選得到了抗性植株，進一步對抗性植株進行了PCR檢測。楊波等（2008）對不同苗齡小麥幼苗莖尖部位進行刺傷后侵染處理30min時，其莖尖uidA基因瞬時表達率可達31%。

Risacher等（2009）描述了一種利用農桿菌在植株上注射小麥未成熟籽粒的轉化方法，平均轉化率5%以上，30%～50%的轉化植株為單拷貝整合，轉基因植株農藝性狀正常。

3 轉化體系優化

3.1 建立高效轉化體系

影響轉化效率的因素有菌株染色體背景、共培養方式、侵染濃度和時間、共培養條件、受體類型和生理狀態、預培養培養基、接種方式、感受態細胞保存條件、植物基因型、靶細胞生理狀態及對轉化植株的篩選程序、外植體處理、再生篩選體系等因素。在受體基因型和受體類型限定的情況下，篩選劑種類和劑量、預處理方式、侵染時間等成為轉化體系優化的幾個重要影響因素。

Ding等（2009）利用含pBI121載體的LBA4404農桿菌侵染小麥成熟胚，以組織化學染色檢測和分子檢測結果為依據，對農桿菌轉化的影響因素進行了探討，認為干燥條件下共培養有利于農桿菌對小麥細胞的侵染。張志清等（2006）使用川農16、川麥32和川育16幼胚及愈傷組織，對農桿菌介導遺傳轉化中幾個重要影響因素進行了研究，結果表明Kan不能抑制幼胚愈傷的生長，G418不能很好地抑制住幼胚生長，在小麥遺傳轉化誘導愈傷和繼代階段L-PPT合適的篩選濃度是2～3mg/L。

3.2 輔助措施提高轉化效率

對轉化細胞進行電擊，利用高壓脈沖作用使細胞膜上形成可逆性的瞬間通道，從而使外源DNA分子進入細胞，操作簡便、轉化效率高，電擊與農桿菌介導法結合使用可以提高轉化效率。接種時振蕩培養能打破細胞表面的氣泡，使農桿菌與外植體的接觸面增大，有利于農桿菌侵染。席夢利等（2007）以杉木莖段為外植體置于侵染液中浸泡進行振蕩接種獲得了抗性芽。該方法在小麥遺傳轉化中的有效性尚未見報導，但可為提高農桿菌轉化效率提供參考。于慧敏等（2005）利用GUS基因的瞬時表達研究了農桿菌介導的胚性愈傷組織小麥遺傳轉化，結果表明超聲波處理30s與適宜的菌液濃度、侵染時間等因素的作用下可使轉化效率得到明顯提高。綜合利用這些優化的轉化條件，可使小麥的瞬時轉化效率提高3倍多。畢瑞明（2008）研究表明，在接種侵染過程中的負壓處理對小麥成熟胚愈傷組織的誘導沒有顯著影響，但對小麥成熟胚的遺傳轉化卻有顯著影響，負壓處理后轉化率最高較對照組提高了10.90倍，最高轉化率可達12.50%，同時能夠提高小麥成熟胚轉化效率。王旭明等（2012）報道了一種超聲波輔助的農桿菌轉化法，將發芽的小麥種子經超聲波處理20min后再經農桿菌浸染，4個小麥品種均得到抗性后代，而不經超聲波處理的種子幾乎看不到轉化的細胞，而經過超聲波處理的種子，幼苗基部的細胞轉化成功。利用超聲波輔助的農桿菌轉化方法轉化小麥能產生可遺傳的后代。

4 發展前景

目前已經有多種目的基因以農桿菌轉化法轉入到小麥中（薛哲勇等，2004；奚亞軍等，2004；畢瑞明等，2006；劉偉華，2006；李林等，2011；黃望啟，2012）。農桿菌介導法操作簡便、成本低、實用性強。此法可以轉移較大的DNA片段，而且所轉DNA很明確的為T-DNA左右邊界之間的序列。其基因插入的低拷貝性，有利于克服基因失活現象，轉化比較溫和。農桿菌介導法不需要原生質體培養再生的過程，其轉化受體可以是不同的植物組織。以上諸多優點，使農桿菌介導法成為最具競爭力的轉化方法，農桿菌介導法將代替基因槍法，成為轉基因研究的主體（周文麟等，1992）。基因槍法與農桿菌法相結合的“Agrolistic”法，利用碳化硅纖維輔助的農桿菌法，超聲波輔助的農桿菌法以及農桿菌法與病毒相結合的“Agroinfection”法等，都可不同程度提高農桿菌的轉化率，在小麥遺傳轉化中的應用也必將越來越廣泛。

[1] 徐春暉，夏光敏，賀晨霞.農桿菌轉化系統研究進展[J].生命科學，2002（4）：223-225.

[2] Hamid R， Shuuji Y， Kinya T， et al. Transgenic plant production mediated by Agrobacteriunim in India rice[J]. Plant Cell Reports， 1996(5)： 727-730.

[3] Ye X D， Salim A B， Andreas K， et al. Engineering the provitam in a (β-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid free) rice endosperm[J]. Science，2000(287)： 303-305.

[4] 楊云霞.小麥農桿菌介導不同遺傳轉化體系的建立及比較研究[D].北京：中國農業科學院，2005.

[5] 王艷麗.小麥不同外植體農桿菌轉化體系研究[D].北京：中國農業科學院，2006.

[6] 衣大龍.農桿菌介導的小麥遺傳轉化研究[D].南京：南京農業大學，2009.

[7] 王艷麗，葉興國，劉艷鵬，等. 農桿菌敏感小麥基因型的篩選研究. 麥類作物學報，2005（6）：6-10.

[8] 張彬，趙明，賈棟，等.小麥基因型對根癌農桿菌菌株敏感性研究[J].山西農業大學學報（自然科學版)，2006（2）：135-137.

[9] 后猛.農桿菌介導小麥遺傳轉化體系的建立及轉基因研究[D].泰安：山東農業大學，2008.

[10] 陶麗莉.小麥幼胚農桿菌轉化體系優化和HMW-GS基因轉化研究[D].北京：中國農業科學院，2009.

[11] 李欣，劉凌云，杜麗璞，等.十二個小麥新品種成熟胚再生性能與農桿菌侵染敏感性評價[J].中國農業科技導報，2012（2）：40-46.

[12] 楊賽奇.不同類型和基因型小麥組培特性及農桿菌浸胚對幼苗生長發育的影響研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2012.

[13] Khurana J， Chugh A， Khurana P. Regeneration from mature and immature embryos and transient gene expression via Agrobacterium-mediated transformation in emmer wheat (Triticum diccocum Schuble). Indian J Exp Biol， 2002(11)： 1295-1303.

[14] Patnaik D， Vishnudasan D， Khurana P. Agrobacterium-mediated transformation of mature embryos of Triticum. aestivum and Triticum durum. Curr Sci， 2006(3)： 307-317.

[15] Ding L P， Li S C， Gao J M， et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation conditions in mature embryos of elite wheat. Mol Biol Rep， 2009 (1)： 29-36.

[16] Wang Y L， Xu M X， Yin G X， et al. Transgenic wheat plants derived from Agrobacterium-mediated transformation of mature embryo tissues. Cereal Res Commun， 2009 (1)： 1-12.

[17] 高春生.小麥再生體系及農桿菌介導的小麥遺傳轉化研究[D].武漢：華中農業大學，2006.

[18] 陳梁鴻，王新望，張文俊，等.抗除草劑草甘膦EPSPS基因在小麥中的轉化.遺傳學報，1999（3）：239-243.

[19] 趙愛菊，劉玉平，李亞軍，等.農桿菌介導小麥花藥遺傳轉化影響因素的研究[J].河北農業科學，2011（2）：85-87.

[20] 張艷敏，郭北海，丁占生，等.小麥農桿菌轉化系統的建立與轉基因植株的獲得.華北農學報，2003（3）：1-3.

[21] Amoah B K， Wu H， Sparks C， et al. Factors influencing Agrobacterium-mediated transient expression of uidA in wheat inflorescence tissue. J Exp Bot， 2001 (358)： 1135-1142.

[22] 黃益洪，周淼平，葉興國，等.農桿菌介導法獲得小麥轉基因植株的研究.作物學報，2002（4）：510-515.

[23] Razzaq A， Zhang Y M， Yang F， et al. In planta transformation of wheat apical meris-tem： a preliminary study. Acta Agric Boreali-Sin， 2005(1)：17-22.

[24] Supartana P， Shimizu T， Nogawa M， et al. Development of simple and efficient in planta transformation method for wheat (Triticum aestivum L.) using Agrobacterium tumefaciens. J Biosci Bioeng， 2006 (3)： 162-170.

[25] Zhao T J， Zhao S Y， Chen H M， et al. Transgenic wheat progeny resistant to powdery mildew generated by Agrobacterium inoculum to the basal portion of wheat seedling. Plant Cell Rep， 2006 (11)： 1199-1204.

[26] 梁欣欣，劉錄祥，趙林姝，等.農桿菌介導法向小麥莖尖導入DREB1A基因的研究初報.麥類作物學報，2007（1）：16-19.

[27] Hess D， Dressler K， Nimnrichter R. Transformation experiments by pipetting Agrobacterium into the spikelets of wheat. Plant Sci， 1990 (2)： 233-244.

[28] Mooney P A， Goodwin P B， Dennis E S， et al. Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tis-sues. Plant Cell， Tissue Organ Cult， 1991 (3)：209-218.

[29] Langridge P， Brettschneider R， Lazzeri P， et al. Transformation of cereals via Agrobacterium and the pollen pathway： a critical assessment. Plant J， 1992 (4)： 631-638.

[30] 何道一，李中存，王洪剛. 農桿菌介導的小麥活體轉化.中國農業科學，2003（12）：1437-1441.

[31] Zale J M， Agarwal S， Loar S， et al. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tu-mefaciens. Plant Cell Rep， 2009 (6)： 903-913.

[32] 楊波，丁莉萍，姚璐，等.苗齡和農桿菌侵染時間對小麥莖尖轉化效率的影響（英文）[J].分子植物育種，2008（2）：358-362.

[33] Risacher T， Craze M， Bowden S， et al. Highly efficient Agrobacterium-mediated transformation of wheat via in planta inoculation. Methods Mol Biol，2009 (2)： 115-124.

[34] 張志清，鄭有良，王丕武，等.農桿菌介導轉化小麥幾個影響因素的再研究[J].四川農業大學學報，2006（1）：1-6. [35] 席夢利，施季森.不同因素對農桿菌介導的杉木轉化效率的影響[J].林業科學，2007（3）：46-50.

[36] 于惠敏，夏光敏，侯丙凱，等.提高農桿菌介導小麥遺傳轉化效率的幾個因素[J].山東大學學報（理學版），2005（6）：120-124.

[37] 畢瑞明.負壓處理對農桿菌介導小麥成熟胚轉化效率的影響[J].生物技術，2008（1）：47-49.

[38] 王旭明，何道一，陳麗萍.超聲波輔助農桿菌介導的小麥遺傳轉化初步研究[J].激光生物學報，2012（2）：176-180.

[39] 薛哲勇，賀晨霞，孫松，等.農桿菌介導的膽堿脫氫酶基因（betA)轉化小麥及影響轉化效率的因素[J].山東大學學報（理學版），2004（3）：104-115.

[40] 奚亞軍，張啟發，林擁軍，等.利用農桿菌浸根法將葉片衰老抑制基PASGA12-I PT導入普通小麥的研究[J].中國農業科學，2004（8）：1235-1238.

[41] 畢瑞明，賈海燕，封德順，等.農桿菌介導抗儲糧害蟲轉基因小麥（Triticum aestivum L.)的獲得及分析[J].生物工程學報，2006（3）：431-437.

[42] 劉偉華，趙秀振，梁虹，等.枯草桿菌果聚糖蔗糖酶基因轉化小麥的研究[J].中國農業科學，2006（2）：231-236.

[43] 李林，肖姍姍，穆東升，等.根癌農桿菌介導hrf1基因轉化小麥增強赤霉病抗性[J].江蘇農業科學，2011（2）：54-56.

[44] 黃望啟.Ghd7基因轉化小麥及農桿菌浸根對小麥幼苗生長發育影響的研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2012.

[45] 周文麟，倪建福，王亞馥，等.外源C4作物DNA導入小麥的研究[J].作物學報，1992（6）：418-423.

S512.035.3

A

1003-4749（2014）10-0008-05

2014-08-18

科技部農業科技成果轉化資金項目(2012GB2D000266)；現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-3-2-35）

楊麗娟(1983-)，女，河南新鄭人，碩士，主要從事小麥分子遺傳育種工作。