利用油茶油體蛋白系統表達金屬硫蛋白的載體構建

曾艷玲，曾曉峰，譚曉風，張黨權

(中南林業科技大學a.經濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室；b.經濟林育種與栽培國家林業局重點實驗室；c.經濟林培育與利用湖南省協同創新中心，湖南 長沙 410004)

油茶是目前我國大力推廣的優良食用油料樹種之一，油茶主產品茶油中油酸含量是所有植物油中最高的[1-3]。長期食用茶油，能降低膽固醇，使人體血脂濃度降低，從而防止血管硬化和血壓升高，降低心腦血管系統疾病的發生幾率[4]。在不斷推廣油茶新品種，開發油茶新產業的同時，如何更好更快地提高茶油及其副產品的質和量是油茶科研的重點。

油體蛋白是包被在油體外部的一層磷脂和蛋白質鑲嵌而成的半單位膜[5]。目前Tzen等[6]利用油體建立了融合蛋白表達系統，利用油體的疏水性，通過離心可以將油體和水相分離，從而得到分離純化的目標融合蛋白，由此誕生了植物生物反應器——油體表達系統，并成功獲得有生物活性的GUS[7]、水蛭素[8]和木聚糖酶[9]。對于油料植物來說，一方面利用油體表達系統可以融合具有營養價值的外源蛋白，改善種子的營養成分，提高種子食用或作為飼料的品質，另一方面，油體煉油的同時，油體蛋白可分離獲得大量的目的蛋白，增加農產品的附加值。為了構建油茶油體蛋白原核表達系統，本研究中選取原核表達載體pET-30a為初始載體，將油茶油體蛋白基因和待表達分離的目的蛋白基因逐步插入載體，旨在為后期在大腸桿菌中誘導表達油茶油體蛋白的同時表達目的融合蛋白提供物質基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

油茶籽為國審品種‘華碩’[10]，采自湖南省長沙市望城縣東城鎮油茶基地，采樣后迅速存于-80℃超低溫冰箱備用。載體pET30a和大腸桿菌Escherichia coli菌株BL21(DE3)為本試驗保存。

1.2 試 劑

RNA提取和逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司，TransStartTM FastPfu DNA Polymerase購自北京全式金生物技術有限公司，核酸內切限制酶及T4 DNA連接酶購自Fermentas公司。

1.3 方 法

1.3.1 RNA提取及cDNA合成

根據Invitrogen公司RNA提取和逆轉錄試劑盒說明書提供的方法操作。

1.3.2 全長cDNA克隆

根據已獲得的油茶油體蛋白基因[11]和油茶金屬硫蛋白基因[12]全長cDNA序列設計引物，并根據軟件分析在引物首端添加合適的核酸內切限制酶。各引物見表1。

表1 引物及酶切位點Table 1 Primers and restriction enzyme cutting sites

PCR反應體系為5×Trans Start Fast Pfu Buffer(Mg2+plus) 10.0μL，2.5mmol/L dNTPs 5.0μL，Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase 1.0μL，正反向引物(10μmol/L)各1.0μL，Trans Start Fast Pfu DNA Polymerase 1.0μL，模板1.0μL，無菌水補充體積至50μL。擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30個循環，之后72℃再延伸8min。

1.3.3 大腸桿菌中的誘導表達

將過夜培養的原始菌液按1∶50稀釋，培養至OD值為0.5(大約3h)為初始誘導濃度，加入IPTG終濃度為0.5mmol/L，誘導時間為4～5h。經SDS-PAGE電泳檢測外源蛋白在大腸桿菌中的誘導表達情況[13]。

1.3.4 電泳檢測

瓊脂糖凝膠電泳：取3μL待檢DNA或PCR產物，與適量溴酚藍-二甲苯青指示緩沖液充分混勻，點樣至1.2％的瓊脂糖EB染色的凝膠孔中，在TAE電泳緩沖液中110 V電壓下電泳30min左右，在自動凝膠成像系統中觀察并照相，根據同時電泳的100bp DNA Plus Ladder譜帶作為相對分子質量參照物，粗略估計每條譜帶的相對分子質量。

SDS-PAGE電泳：將等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液加入到蛋白樣品中，沸水浴處理5～10min，然后12 000r/min離心1min，吸取20～40 μL上樣。配制12％的分離膠和5％的濃縮膠。按照8 V/cm的電壓比例進行電泳，待溴酚藍完全進入分離膠后，將電壓調至15 V/cm，繼續電泳至溴酚藍跑出膠外。電泳完成后將凝膠取出，考馬斯亮蘭R-250染色，脫色4～5次，進行凝膠成像。

2 結果與分析

2.1 油體蛋白表達系統構建策略

理論上，構建成功的原核油體蛋白表達系統在轉化大腸桿菌后，能表達有活性的融合蛋白，不需要繁瑣的蛋白純化過程，而是利用油體中油體蛋白、三酰甘油酯(TAG)和單層凝脂分子(PL)的天然比例混合后，在體外形成油體，通過油體在中性介質中離心漂浮，則可以將融合蛋白與其它雜蛋白分離，然后利用蛋白酶將目的融合蛋白從油體上切離而獲得純化的目的蛋白。

本研究中選擇常用的原核表達載體pET-30a，采用“PCR+酶切連接”的方法將油茶油體蛋白基因Co_oleI插入載體，構建油體蛋白表達系統入門重組載體；同樣采用“PCR+酶切連接”的方法，將準備通過油體蛋白表達系統獲得的活性短肽基因(本研究中擬采用油茶金屬硫蛋白基因)，插入到入門重組載體的Co_oleI基因下游，并且確保2個基因之間有完整可表達的凝血蛋白酶位點，完成油茶油體蛋白表達系統的構建(見圖1)。酶切位點選擇遵循以下原則：屬于載體多克隆位點，但是目的基因序列內部無此酶切位點；油體蛋白基因插入在待分離目的基因上游，且兩者之間有可供酶切的凝血蛋白酶位點。

圖1 油體蛋白表達系統構建流程(以金屬硫蛋白基因為例)Fig.1 Construction of oleosin expression system (metallothionein gene as example)

2.2 油茶油體蛋白基因分離及原核表達

以油茶‘華碩’近成熟種仁cDNA為模板，采用特異引物，PCR擴展獲得油茶油體蛋白基因Co_oleI，插入載體pET30a(+)多克隆位點，通過擴增、電泳檢測(見圖2A)及上海博尚生物技術有限公司測序確定pET30a(+)/Co_oleI重組載體構建成功，轉化大腸桿菌BL21誘導表達，產物大小約16.68kDa(見圖2B)，與預期一致，說明入門重組載體構建成功。

2.3 油茶金屬硫蛋白基因分離及原核表達

以油茶‘華碩’近成熟種仁cDNA為模板，采用特異引物，經PCR擴展獲得油茶金屬硫蛋白基因Co_comtI，插入載體pET30a(+)多克隆位點，通過擴增、電泳檢測(見圖3A)及上海博尚生物技術有限公司測序確定pET30a(+)/Co_comtI重組載體構建成功，轉化大腸桿菌BL21誘導表達，產物大小約7.87kDa(見圖3B)，與預期一致，說明油茶金屬硫蛋白原核表達體系構建成功。

圖2 油茶油體蛋白表達系統入門重組載體構建電泳Fig.2 Gel electrophoresis of the entry recombinant vector of oleosin expression system in C.oleifera

圖3 油茶金屬硫蛋白基因重組載體構建電泳Fig.3 Gel electrophoresis of the recombinant vector of metallothionein gene in C.oleifera

2.4 油茶油體蛋白+金屬硫蛋白的融合表達載體檢測

根據本項目中擬定的油茶油體蛋白表達系統構建策略，將油茶金屬硫蛋白基因酶切連接至入門重組載體中，經擴增、電泳檢測及上海博尚生物技術有限公司測序確定pET30a(+)/Co_oleI/Co_ComtI重組質粒構建成功(見圖4)。

3 結 論

圖4 油體蛋白表達系統重組載體凝膠電泳檢測Fig.4 Gel electrophoresis of oleosin expression system recombinant vector

油體蛋白是油體所特有的一類蛋白，一般占種子總蛋白的2％～10％，對維持油體的穩定極為重要[14]。由于油體蛋白在油料植物種子中高水平積累，當外源基因以融合方式與油體蛋白一起表達時，表達產物通常也能達到較高的水平，而且外源蛋白和油體蛋白形成的重組融合蛋白非常穩定，可在種子中長期、穩定貯藏[15-16]。因此，新型的植物生物反應器(油體表達系統)應運而生。

油體表達系統生產外源蛋白的原理與重組質粒在原核生物體內大量表達外源基因相似，關鍵步驟在于載體構建。本研究中以大腸桿菌為寄主進行初步試驗，結果表明構建油體表達系統需要采用兩步克隆法，先構建油體蛋白基因原核表達載體，然后在油體蛋白基因下游插入外源蛋白基因，因為原核生物為多順反子結構，一個啟動子能夠同時調控多個結構基因表達，通過兩步克隆法構建的油體表達系統能夠形成“外源蛋白+油體蛋白”的重組融合蛋白。本研究中成功構建了油茶油體蛋白表達系統的原核重組載體，但是能否正確表達有活性的外源蛋白還需進一步的條件優化試驗。油茶油體蛋白表達系統另一關鍵技術是在外源蛋白和油體蛋白之間引入一個可被蛋白酶酶解的短肽結構。有研究表明[17]，油體蛋白的兩端插入短肽不會影響油體蛋白在油體上的定位。同時，利用油體中油體蛋白、甘油三酯和磷脂酸肌醇的天然比例混合后，能夠在體外形成油體，通過油體在中性介質中離心漂浮，則可以將融合蛋白與其它雜蛋白分離，然后利用蛋白酶將目的融合蛋白從油體上切離而獲得純化的外源蛋白。

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