植物源ACE抑制肽研究進展

郭顯榮 ，黃衛文 ，b，龔吉軍 ，b，王 揮 ，李忠海 ，b

(中南林業科技大學a.食品科學與工程學院；b.稻谷及副產物深加工國家工程實驗室，湖南 長沙 410004)

高血壓是一種常見的心血管疾病。我國有2億人患有高血壓，每年近150萬人因高血壓而死亡，這已成為嚴重的公共衛生問題之一[1]。現代醫學研究結果表明，血管緊張素轉化酶(Angiotensin I-converting enzyme，ACE)的高活性被認為是導致高血壓的主要原因之一。ACE抑制肽具有抗氧化、降血脂、調節免疫、抑菌等功效，是治療原發性高血壓和心力衰竭的有效藥物[2-3]。化學合成的 ACE 抑制劑如巰丙脯氨酸(Captopril)在達到降血壓目的的同時往往伴有一定的副作用，如咳嗽、皮疹等[4]。從食物蛋白中水解得到的降血壓肽具有人工合成的降壓藥物不可比擬的高安全性與零副作用的特點，如美國以三文魚加工副產物為原料，水解所得降血壓肽的降壓效果良好。每天攝入1.5g該多肽就能使中等強度高血壓患者的血壓趨于平穩，用量少且效果好。來源于植物的ACE 抑制肽在降血壓的過程中表現出明顯的降壓效果且無毒副作用，引起了人們的廣泛關注[5-7]。

近年來學術界對于植物源ACE抑制肽的研究報道較多，國內外學者對ACE抑制肽在降血壓的作用機理方面進行了深入的研究，在此基礎上，以花生、玉米、菜籽、棉籽、米糠、油茶粕等為原料[8-12]，經酶解或發酵的手段獲得了具有較好ACE抑制活性的多肽片段。但是，從不同植物中獲取的ACE抑制肽的氨基酸序列有所差異，且提取的方式不盡相同，分離純化也較為復雜，故ACE抑制肽在實際生產和應用中還存在許多問題[13]。因此，高效制備天然、安全、無毒副作用的 ACE 抑制肽已成為當前研究的熱點。

1 ACE及ACE抑制肽(ACEI)的作用機理

ACE是一種含鋅二肽羧基肽酶，其作用機理(如圖1所示)主要表現在如下兩個系統中：一是腎素-血管緊張系統(Renin-Angiotension System，RAS)，ACE將血管緊張素I(AngⅠ)轉換為血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，而AngⅡ可加強心肌的收縮力，使血壓升高；二是激肽釋放酶-激肽系統(Kalikkrein-Kinin System，KKS)，KKS為降壓系統，其中舒緩激肽可增強毛細血管的通透性，使血壓下降，而引起高血壓的主要原因是ACE和舒緩激肽發生反應，使位于舒緩激肽C末端的二肽Phe-Arg缺失，成為失活片段。因此，抑制ACE的活性對于降血壓有著積極的作用，而尋求ACE抑制劑也成為降血壓研究中的熱門話題。

圖1 ACE對血壓的調節及ACEI的作用機理Fig.1 Mechanisms of ACE regulating blood pressure and ACEI acting

ACEI活性強度主要取決于以下兩個因素：一是肽段分子量；二是氨基酸組成。據Mullally等人[14]的研究結果，具有較高降血壓效應的多肽片段的分子量大小主要集中在1kDa以下。至于氨基酸組成與降血壓活性之間的關系，Cheung等人[15]研究的結論是，一般肽段含有的疏水性氨基酸越多，其ACE抑制活性越強。當C末端為芳香族氨基酸(如Phe、Tyr、Trp或Pro)，N末端為長鏈或含支鏈的疏水性氨基酸(如Leu、Ile、Val)時，其降血壓活性相對較強，但若N末端含有Pro，則其降壓活性反而降低。

2 ACEI的制備方法

2.1 酶 法

酶法主要是在溫和的條件下采用蛋白酶催化水解植物蛋白生成具有降血壓活性的多肽片段，該方法所需條件溫和，原料來源廣泛，安全性高，無毒副作用，是制備降血壓肽的主要手段。堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃胰蛋白酶、膠原蛋白酶等是目前應用于制備降血壓肽研究的主要酶類[16]。

劉 佳 等 人[17]采 用 Protease N、ProteaseS、Alcalase、Protamex、木瓜蛋白酶這五種蛋白酶分別對中性蛋白酶酶解后的大豆蛋白產物進行進一步的水解，以期制備更高活性的ACE抑制肽，其研究結果表明，Protease N是最合適的蛋白酶，即所獲的大豆多肽的ACE抑制活性最高；其最優的制備條件為：底物濃度為5％，加酶量為2.0％，pH 值為7.0，溫度為55℃。張曉平等人[18]以燕麥蛋白為原料，選用Neutrase、Protamex 和Alcalase三種蛋白酶分別進行單酶水解或自由組合的聯合水解，其研究結果表明，單酶反應時，堿性蛋白酶為最適蛋白酶，水解產物燕麥多肽對ACE的抑制活性較強；而聯合水解的優勢并不明顯。

2.2 發酵法

國內外的有關研究結果表明，發酵生產ACE抑制肽主要采用液態發酵方法，目前用于液體發酵的菌種主要包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、米曲霉。劉顯儒[19]分別采用上述菌種，以米糠為原料，進行了單一菌和復合菌液態發酵制備ACE抑制肽試驗，結果表明，復合菌(枯草芽孢桿菌和黑曲霉)液態發酵所制得的米糠多肽對ACE的抑制活性最高，其最優的制備條件為：底物濃度5.0％，時間22h，溫度34℃，接種比例為2∶1；ACE抑制率為70％。

將以酶法和發酵法制得的多肽片段進行進一步的分離純化，以期得到降壓效果最好的單一組分。目前應用于ACEI分離純化的方法主要有超濾法、凝膠層析色譜法、離子交換層析、高效液相色譜、凝膠電泳等。在對肽段進行分離純化時，一般會將分離原理不同的兩種方法或手段結合起來使用，從而使分離的肽段更純。Ma等人[20]將酶解后得到的蕎麥多肽液進行分離純化，首先采用Sephadex G-25陰離子交換層析法對蕎麥多肽液進行初步分級分離，得到分子量大小不同的四種組分，分別測其ACE抑制活性，并用IC50(抑制50％ACE活性所用的ACE抑制肽的濃度)來表示，ACE活性抑制最強組分的抑制率為91％，IC50為25.7 μg/mL；然后采用反相高效液相色譜法對上述組分進行進一步的純化，其中ACE活性抑制最強組分的抑制率為96％，IC50為6.3 μg/mL。倪莉等人[21]以可溶性素絲粉末為原料，直接用堿性蛋白酶水解，制備了具有較高ACE抑制活性的絲素肽，以質譜法檢測到的其氨基酸組成為Gly-Tyr。但由于ACE抑制肽氨基酸組成的多樣性，肽段長度不同，極性和疏水性也不盡相同，所以有針對性地設計純化方案對于提高ACE抑制肽的純度非常有效。

3 ACE抑制肽的分析檢測方法

3.1 體外檢測方法

目前體外檢測方法主要有紫外分光光度法、高效液相色譜法和高效毛細管電泳(HPCE)法這三種。

紫外分光光度法：Cushman和Cheung[22]于20世紀70年代建立了以紫外分光光度測定ACE抑制肽活性的方法。其基本原理是，在37℃、pH為8.3的條件下，利用ACE催化水解馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)生成馬尿酸(Hip)，當加入ACE抑制肽時，催化水解反應被抑制，生成的馬尿酸含量減少。由于馬尿酸在紫外228nm處具有特征吸收峰，故可根據馬尿酸吸收值的大小來衡量ACE的抑制活性。但是，該方法操作較為復雜，其中HHL在紫外228nm處也有一定的吸收峰，所以檢測結果不夠精確，易產生誤差。

高效液相色譜法(HPLC)：2002年Wu等人[23]人改良了Cushman和Cheung的方法，采用高效液相色譜法檢測ACE抑制活性。該方法利用RP-HPLC系統，采用梯度洗脫的方式，使得HHL和反應產生的馬尿酸得到很好的分離，再進一步通過紫外檢測器于228nm的波長下在線檢測反應中馬尿酸吸收值的大小。該方法快捷、簡便，精確度高。 Danny等人[24]將電子質譜與液相色譜進行耦聯，實現了降壓肽抑制活性和組成的在線檢測。

高效毛細管電泳(HPCE)法是一種新型的ACEI分析技術，其原理是以高壓電場為驅動力，樣品中各組分的離子或荷電粒子在毛細管中按其濃度和分配系數的差異進行高效快速的液相分級分離。2003年，辛志宏等人[25]在以麥胚蛋白為原料制備降血壓肽的研究中，所得降血壓肽活性較高。該法的優點在于釆用自動進樣的方法，避免了人為誤差，溶劑用量少，分析時間短。

此外，還可以采用薄層掃描法[26]和熒光分光光度法[27]進行體外檢測。

3.2 體內檢測方法

體內檢測試驗對于評價ACE抑制肽活性是不可或缺的。由于SHR的血壓與人類血壓相似，所以采用原發性高血壓大白鼠(Spontaneously Hypertensive Rat，SHR)建立的模型是研究降血壓肽較好的動物模型[28]，其試驗結果在一定范圍內可以作為評價降血壓肽生物學效應的參考依據。在一段時間內定期測量SHR的動脈收縮壓，以此判定ACE抑制肽的降血壓功效。降血壓肽的攝入方法主要采用胃插管法和直接口服兩種方式。攝入周期分為一次性檢測和長期檢測兩種：一次性檢測，主要檢測SHR攝入降血壓肽前后血壓的變化情況，檢測時間一般為2h；長期檢測，以周或月為時間單位，幾周或幾個月連續攝入ACE抑制肽，同時以合成的降血壓藥物如卡托普利(Captopril)作為對照，觀察收縮壓的變化情況。

4 油茶粕ACE抑制肽的研究現狀

油茶(Camellia Oleifera Abel)是世界四大木本食用油料樹種之一，是我國所特有的經濟林植物。主要分布在淮河-秦嶺以南，北回歸線以北，云南怒江流域、青藏高原以東，東南海岸、臺灣以西。我國東部油茶種植區主要分布在海拔 800m以下的區域，而西部大多分布于海拔2 000m以上的區域[29]。近十年來，油茶的種植技術[30-31]、茶果成分及功能分析[32]、基因遺傳學特性[33]等已成為我國經濟林樹種的研究熱點。油茶粕即油茶榨完油所產生的副產物，經檢測分析，油茶粕中含有大量的蛋白質、淀粉、茶皂素和粗纖維，其中蛋白質含量為12％～15％，是一種很好的蛋白飼料[34]。這種蛋白質由17種氨基酸組成，其中蘇氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等 7種是人體必需的氨基酸。在溫和的條件下，采用酶解法將油茶粕蛋白水解，可獲得具有生物活性的多肽片段及游離氨基酸等物質，這些物質具有降血壓、抗氧化、調節免疫力等功能。目前，研究制備油茶粕蛋白及多肽的報道相對較多，但有關酶解油茶粕蛋白制備降血壓肽的研究，如對于適宜蛋白酶、特定酶解條件及多肽膜分離等關鍵技術的研究均處于試驗探索階段。

油茶粕蛋白的提取方法主要采用傳統的堿提酸沉法，該方法操作簡單，適用于工業化生產。于衛紅等人[35]、孫英等人[36]分別采用纖維素酶預處理和超聲預處理法來提高油茶粕蛋白的提取率，效果顯著。對于油茶粕蛋白酶解制備ACE抑制肽，大多選用堿性蛋白酶。趙延華[37]以酶解后多肽液的ACE抑制率為指標，篩選出的最適酶為堿性蛋白酶，其最優的酶解條件為：pH為8.1，酶與底物之比為1.57％，溫度50.5℃，時間6.66h。在此最佳條件下，油茶粕多肽的ACEI值為86.17％。丁丹華[38]采用中性蛋白酶酶解油茶粕蛋白制備ACE抑制肽，其ACEI為42％。龔吉軍[39]采用響應面分析法對Alcalase酶解制備油茶粕多肽的條件進行了優化(ACEI達到84％)，并將分離純化后的油茶粕多肽(MW＜3kDa)用于動物實驗，結果表明，油茶粕多肽(MW＜3kDa)可有效降低SHR的SBP，即具有良好的體內降壓作用。

本實驗室采用堿提酸沉法從油茶粕中提取油茶粕蛋白[40]，經過蛋白酶的定向酶解，獲得了具有一定ACE抑制活性的油茶肽；還從國外引進四種蛋白酶——Bacillus licheniformis、Aspergillus oryzae、Bacillus sp、Bacillus amyloliquefaciens 對油茶粕蛋白進行單酶水解和聯合水解，結果表明，采用4％的Bacillus licheniformis水解效果最佳，其ACEI為52％。酶解液分別經3、5、10kDa的超濾膜進行分級分離，得到分子量小于3kDa的組分ACE，且其抑制率最強，為74％，然后采用凝膠過濾層析和HPLC再將此組分進一步分離純化，冷凍干燥，得到了含量高、活性強的油茶粕ACE抑制肽。有關研究結果表明，油茶粕蛋白中富含Tyr、Pro、Phe和Leu等疏水性氨基酸，具有制備降血壓多肽的功能成分[15]，所以酶法制備油茶粕ACE抑制肽是可行的。

5 展 望

21世紀是生物科技時代，尋求天然、健康的保健食品來調節人體機能的理念，已被廣大消費者所認可和接受。植物源ACE抑制肽，是在溫和條件下經過食品級蛋白酶的水解而制得的，其穩定性和安全性比合成藥物高，且無毒副作用。長期服用不僅具有較好的降血壓作用，還具有抗氧化、促進免疫及易消化吸收等功能。因此，植物源降血壓肽具有良好的發展前景。

盡管目前國內外在研究ACE抑制肽的分離純化方面較為復雜，投入和耗時都較多，仍有許多關鍵技術需要攻破，但隨著科學研究的深入，蛋白酶、酶解及膜分離等關鍵技術的發展，食物源蛋白降血壓活性肽制備技術將更加成熟。利用我國豐富的油茶粕蛋白資源，研制高活性降血壓肽產品，實現油茶副產物的高效利用，將是植物源ACE抑制肽研究開發的重要內容之一。

[1] 中華人民共和國衛生部,中華人民共和國科學技術部,中華人民共和國國家統計局.中國居民營養與健康狀況[M].北京:人民衛生出版社,2005:15-16.

[2] 葛 洪.高血壓病的并發癥及其危害[J].中老年保健,2004,(9):6-7.

[3] 何子安,戚挺華,曾廣信,等.中國蝮蛇毒中舒緩激肽增強肽的研究[J].生物化學與生物物理學報,1981,13(5):451-459.

[4] L IG H,L E G W,SHIY H,et al.Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food proteins and their physiological and pharmacological effects[J].Nutr,2004,27:469-486.

[5] POTTE R S M.Overview of proposed mechanisms for the hypocholesterolemic effect of soy [J].Nutr,1995,125:606-611.

[6] MIY OSHIS,KANE KO T,ISHIZAWAY,et al.Structures and activities of angiotensin converting enzyme inhibitors[J].Agric Biol Chem,1991,55:1313-1318.

[7] SE KI,OSAJIMAK.Quantitative an analysis of digestion resistant ACE inhibitory peptide by small intestinal mucoal[J].Nippon Shokuhin Kag Kaishi,1996,43:967-969.

[8] 江利華,王 璋.花生ACE抑制肽的分離純化、結構鑒定及體內降血壓功能研究[J].食品工業科技,2009,30(10):94-100.

[9] 劉 勇,馬海樂.玉米ACEI活性肽體內降血壓功能試驗研究[J].中國糧油學報,2006,21(6):55-57.

[10] 王立峰,金 立.液態發酵法制備菜籽ACE抑制肽培養基條件優化[J].食品科學,2010,31(21):226-230.

[11] 常 通,曹郁生,李海星,等.棉籽蛋白發酵制備ACE抑制肽條件的優化[J].食品與發酵工業,2010,36(12):104-111.

[12] 朱 彬,鐘海雁,曹清明,等.油茶活性成分研究進展與展望[J].經濟林研究,2010,28(3):140-145.

[13] 劉 煥,黎觀紅,施用暉,等.花生蛋白堿性蛋白酶水解物對血管緊張素轉化酶抑制作用的初步研究[J].花生學報,2005,34(1):8-14.

[14] Mullally M,Meisel H,Fitzgerald R J.Angiotensin-I-converting enzyme inhibitory activities of gastric and pancreatic proteinase digests of whey protein[J].Int DairyJ,2001,7:299-203.

[15] 賈俊強,馬海樂.降血壓肽的構效關系研究[J].中國糧油學報,2009,24(5):110- 114.

[16] 吳建平,丁霄林.大豆降壓肽的研制(I)——生產高活性ACEI肽酶系的篩選[J].中國油脂,1998,3(2):49-51.

[17] 劉 佳,王興國,楊嚴俊.酶法制備大豆蛋白降血壓肽的研究[J].中國油脂,2008,33(9):6-10.

[18] 張曉平,趙世鋒.酶解燕麥蛋白制備ACE抑制肽的研究[J].食品科學,2009,30(11):189—195.

[19] 劉顯儒.復合菌液態發酵米糠制備ACE抑制肽[D].哈爾濱:哈爾濱商業大學,2013.

[20] MAM S,BAE IY,L E E H G,et al.Puri fi cation and identi fi cation of angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptide from buckwheat [J].Food Chemistry,2006,96:36-42.

[21] 倪 莉,陶冠軍,戴 軍,等.血管緊張素轉化酶抑制劑——絲素肽的分離、純化和結構鑒定[J].色譜,2001,19(3):222-225.

[22] Cushman D W,Cheung H S.Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-I-converting enzyme of rabbit lung[J].Biochem Pharmacol,1971,20:1637- 1648.

[23] Jianping Wu,Rotimi E Aluko,Alister D Muirl.Improved method for direct high-performance liquid chromatography assay of angiotensin-converting enzyme-catalyzed reactions[J].Journal of Chromatography A,2002,950:125-130.

[24] Danny A van Elswijk,Otto Diefenbach,Sonja van der Berg,et al.Rapid detection and identi fi cation of angiotensin-converting enzyme inhibitors by on-line liquid chromatography-biochemical detection coupled to electrospray mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2003,1020:45- 58.

[25] 辛志宏,吳守一.從麥胚蛋白質中制備降血壓肽的研究[J].食品科學,2003,24(10):120-123.

[26] 朱 培,鐘海雁,黃衛文,等.用薄層掃描法測定油茶粕蛋白水解物的多肽[J].經濟林研究,2013,31(2):142-145.

[27] 潘 曦,查 艷.熒光分光光度法測定血管緊張素轉換酶[J].貴陽醫學院學報,1998,23(1):82-83.

[28] Yuko Yamada,Ding X L.Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides[J].Food Research International,2002,35:367-375.

[29] 朱 勇,王湘瑩,馬錦林,等.不同物種油茶籽仁含油率及其茶油的脂肪酸組成[J].經濟林研究,2013,31(2):134-137.

[30] 王玉娟,陳永忠,王 瑞,等.覆草間種對油茶林土壤養分及生長量影響的主成分分析[J].中南林業科技大學學報,2010,30(6):43-49.

[31] 雷小林,黃建建,何小三,等.高產油茶超級壯苗關鍵培育技術的研究[J].中南林業科技大學學報,2011,31(6):39-44.

[32] 王湘南,陳永忠,伍利奇,等.油茶種子含油率和脂肪酸組成研究[J].中南林業科技大學學報,2008,28(3):11-17.

[33] 朱鳳云,陳鴻鵬,譚曉風,等.油茶脂氧合酶基因全長cDNA的克隆與序列分析[J].中南林業科技大學學報,2011,31(10):45-51.

[34] 馬 力,陳永忠,彭邵鋒,等.油茶粕最優培養基及混菌生產蛋白飼料的研究[J].中南林業科技大學學報,2013,33(10):34-37.

[35] 于紅衛,吳峰華,朱伯榮.酶預處理對油茶籽粕蛋白提取效果的影響[J].農業機械,2011,(9):59-63.

[36] 孫 英,劉國琴,閻乃珺.超聲預處理提高茶籽粕多肽抗氧化活性的研究[J].食品工業科技,2012,33(5):52-58.

[37] 趙延華.油茶粕蛋白提取及其水解物生物活性研究[D].長沙:中南林業科技大學,2012.

[38] 丁丹華.冷榨油茶籽制備油茶籽粕蛋白及多膚的研究[D].武漢:華中農業大學,2010.

[39] 龔吉軍.油茶粕多肽的制備及其生物活性研究[D].長沙:中南林業科技大學,2011.

[40] 郭顯榮,黃衛文,龔吉軍,等.不同提油方法的油茶粕蛋白制備工藝研究[J].食品與機械,2013,29(6):147-149,175.