新疆棗園土壤解鉀微生物菌株篩選及鑒定

孫林琦，郭藝鵬，王海儒，錢立龍，李建貴

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊 830052)

棗Zizyphus jujubaMill，又名華棗、紅棗，為鼠李科Rhamnaceae棗屬ZizyphusMill植物[1]。紅棗作為中國特有的經(jīng)濟(jì)林樹種，已有4 000年的栽培歷史，在新疆也有較長的栽培時間。新疆擁有豐富的光熱資源，光照時間長、晝夜溫差大、光合效率高、碳水化合物積累多，具有優(yōu)越的生產(chǎn)高品質(zhì)特色林果的自然條件[2]。因此，新疆是我國最優(yōu)紅棗生產(chǎn)基地之一。新疆紅棗品質(zhì)優(yōu)良，果實含糖量較高，含酸量低，味道甜美。此外，新疆紅棗干果還具有果皮光滑褶皺較少，果肉多，纖維少，香氣濃，口感細(xì)膩等特點[3]。近年來，新疆地區(qū)紅棗種植面積迅速擴(kuò)大，紅棗已成為新疆特色林果的支柱產(chǎn)業(yè)。

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物的種類、數(shù)量及其變化是衡量土壤肥力狀況的重要指標(biāo)[4]。解鉀菌是從土壤中分離出的一種能分化鋁硅酸鹽和磷灰石類礦物的細(xì)菌，能作為微生物肥料，能夠分解鉀長石、磷灰石等不溶性的硅鋁酸鹽無機(jī)礦物質(zhì)，促進(jìn)難溶性的鉀、磷、硅、鎂等養(yǎng)分元素轉(zhuǎn)化成可溶性養(yǎng)分，增加土壤中速效養(yǎng)分的含量，促進(jìn)作物生長發(fā)育，提高產(chǎn)量[5-7]。鉀細(xì)菌肥施入土壤后，除了可為作物提供速效性鉀、磷、硅等營養(yǎng)元素外，還具有促使土壤結(jié)晶構(gòu)造破壞的作用，從而有利于農(nóng)作物的營養(yǎng)吸收[8-9]。隨著農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展，中國約有60％的耕地缺鉀，耕地速效鉀含量正以每年2×10-6～3×10-6的速度下降，造成土壤中氮、磷、鉀3種元素比例失調(diào)，影響了其發(fā)展[10]。因此，開辟新的高效、成本低并且不污染環(huán)境的解鉀菌，充分利用土壤中的鉀素資源，對發(fā)展生態(tài)、經(jīng)濟(jì)農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 土壤樣品

在新疆和田、喀什、阿克蘇、庫爾勒、吐魯番等地分別取8年生灰棗根際土壤，采樣時，鏟去表土，深挖10～20cm，將根際土壤連同棗樹根一同裝入無菌袋，編號，于4℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

解鉀分離采用的培養(yǎng)基：蔗糖10g，酵母膏0.5g，硫酸銨1g，磷酸氫二鈉2g，硫酸鎂0.5g，碳酸鈣1.0g，鉀長石粉1.0g，瓊脂15g，蒸餾水1 000mL。

細(xì)菌分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10g，氯化鈉5.0g，瓊脂15g，pH值6.8～7.2，蒸餾水1 000mL。

1.1.3 試 劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 方 法

1.2.1 鉀細(xì)菌的分離純化

參考《土壤與環(huán)境微生物研究法》中鉀細(xì)菌的分離純化方法進(jìn)行。

1.2.2 液體培養(yǎng)法測定有效鉀

(1)測定方法 配制解鉀培養(yǎng)基(無鉀)按95mL分裝于250mL三角瓶，并加入0.5g準(zhǔn)確稱取的鉀礦粉，121℃滅菌30min，待測菌懸液以5％的接種量接入搖瓶菌種，每個菌種做3個平行，同時設(shè)無接種對照，30℃搖床震蕩培養(yǎng)72h。

(2)發(fā)酵液的處理 對照組取培養(yǎng)72h的培養(yǎng)液20mL，經(jīng)4℃ 5 000r/min離心15min，將全部離心上清液放入50mL消煮管中，加入5mL濃硫酸與2mL的過氧化氫溶液在消煮爐消煮，并反復(fù)加幾次20％過氧化氫溶液，至粘性物質(zhì)完全消化后，用蒸餾水定容至50mL。利用火焰分光光度計法測定其解鉀能力，使用火焰光度計測定其中K+含量。

1.2.3 解鉀細(xì)菌耐利福平菌株誘導(dǎo)

參照黃青云等[11]采用的含利福平(Rf)肉湯培養(yǎng)法，進(jìn)行人工誘導(dǎo)。

1.2.4 解鉀菌株定殖試驗

將利福平標(biāo)記過的解鉀菌培養(yǎng)液經(jīng)計數(shù)達(dá)108cfu/mL后，將其稀釋液接種于棗樹根際，每顆樹澆灌菌液原液200mL，澆灌時需用清水將原液稀釋至1 000mL，先將紅棗苗的表層土鏟除(5cm)，當(dāng)達(dá)到根部時停止鏟土，將菌液澆灌到根際，然后將表土重新覆蓋到根部。以不接菌為對照。45d后帶回實驗室進(jìn)行解鉀能力的再測定。

1.2.5 解鉀菌株的鑒定

(1)細(xì)菌基因組DNA的提取 運用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對其篩選出的解鉀細(xì)菌進(jìn)行DNA提取。

(2)核酸濃度測定儀檢測DNA濃度 用核酸濃度測定儀測定DNA提取液的OD260、OD280的值，以及OD260/OD280值，并計算DNA濃度。

(3)細(xì)菌16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增 根據(jù)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供的PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增。

(4)PCR產(chǎn)物的電泳檢測 取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，加入1μL上樣緩沖液，再加入4μL的ddH2O混勻。點入預(yù)先制備好的1％的瓊脂糖凝膠中，電泳1h。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

(5)擴(kuò)增片段的回收 根據(jù)上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供的擴(kuò)增片段回收方法進(jìn)行回收。

(6)DNA序列測定及分析 將回收的片段送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，測序引物為16S PCR引物。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast分析比對，鑒定其種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 解鉀菌株的初篩

將土壤懸液均勻涂布在硅酸鹽固體培養(yǎng)基上，在恒溫28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4d，由于土壤中存在大量的解鉀微生物，在分離純化過程中，根據(jù)平板生長菌落的大小、顏色及形狀挑選透明、光滑、粘性強(qiáng)、凸起富有彈性長勢良好的菌株，初步得到解鉀細(xì)菌共78株菌株。

解鉀微生物在土壤中分布情況見表1。由表1可以看出，新疆干旱地區(qū)紅棗根系土壤中廣泛分布著解鉀微生物，其中阿克蘇和和田地區(qū)土壤中解鉀微生物最多。不同區(qū)域同種類型土壤中解鉀微生物種類和數(shù)量有所不同。

表1 解鉀微生物在土壤中分布情況Table 1 Distribution of the potassium-releasing microorganisms in the soil between

2.2 解鉀菌株解鉀能力的測定

為了篩選出解鉀高效菌株，采用火焰分光光度計法測定初篩78株解鉀菌株的解鉀能力，得到具有較好解鉀效果的菌株26株(見圖1)，占平板初篩菌株數(shù)的33.33％。通過圖1可以看出，這26個菌株均具有較強(qiáng)的解鉀能力，其發(fā)酵液中的鉀含量在20 μg/mL以上，最高的可達(dá)56 μg/mL，解鉀活性范圍分布在20～56 μg/mL，其中25 μg/mL以下的菌株有4株，占15.38％；25～30 μg/mL的菌株有13株，占50％；30 μg/mL以上的9株，占34.62％。由此可見，25～30 μg/mL的菌株占所測菌株的大多數(shù)。解鉀能力較強(qiáng)的菌株有KZ-1、KZ-3、KZ-5、KZ-23、KZ-24、KZ-25、KZ-26。

圖1 解鉀能力測定Fig.1 Determination of potassium-releasing capacity

2.3 利福平誘導(dǎo)解鉀菌株解鉀能力的測定

將26株解鉀能力較好的菌株經(jīng)利福平標(biāo)記后(350 μg/mL)，搖瓶培養(yǎng)7d，測定其發(fā)酵液中的鉀含量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 經(jīng)利福平誘導(dǎo)后解鉀能力測試Fig.2 Test of potassium-releasing ability after induced by rifampin

從圖2中可以看出，解鉀菌株在經(jīng)利福平標(biāo)記后，26株解鉀菌株仍具有較強(qiáng)的解鉀能力，解鉀活性范圍分布在12～43 μg/mL之間。與利福平標(biāo)記之前相比，同一菌株的解鉀能力前后有較大的差異，經(jīng)過抗生素的誘導(dǎo)，菌株發(fā)生了變異，部分解鉀能力強(qiáng)的菌株，經(jīng)利福平標(biāo)記后解鉀能力變?nèi)酢＝?jīng)利福平標(biāo)記后，有較強(qiáng)解鉀能力的菌株是KZ-2、KZ-8、KZ-9、KZ-12、KZ-17等。

2.4 定殖回收菌株解鉀能力的測定

將定殖35d后的解鉀菌株進(jìn)行回收，純化培養(yǎng)后，放入解鉀培養(yǎng)液中，30℃，180r/min搖瓶培養(yǎng)3、7、10、15d后，選出培養(yǎng)效果較好的菌株進(jìn)行其解鉀能力測定，結(jié)果如圖3。

從圖3中可以看出，定殖后的菌株經(jīng)過35d傳代后，很多菌株不再具有解鉀能力，傳代35d后仍能保持良好解鉀能力的菌株有KZ-1、KZ-2、KZ-3、KZ-4、KZ-6、KZ-7、KZ-8、KZ-9、KZ-15、KZ-18、KZ-19、KZ-21、KZ-22、和 KZ-26。通過搖床發(fā)酵培養(yǎng)，未發(fā)現(xiàn)菌株活性的變化。經(jīng)72h培養(yǎng)后，KZ-3菌株解鉀活性最強(qiáng)(35 μg/mL)，而 KZ-8、KZ-18、KZ-19、KZ-22無 解 鉀 活 性。在菌株搖床培養(yǎng)第7天時，菌株的解鉀能力逐漸增強(qiáng)，其中K-Z6解鉀活性最強(qiáng)(35 μg/mL)，而KZ-3活性為最低值5 μg/mL。在菌株搖床培養(yǎng)第10天時，解鉀活性均為逐漸上升的趨勢，其中KZ-6菌株的活性最強(qiáng)(39 μg/mL)。在搖床培養(yǎng)第15天時，有的菌株解鉀活性仍在繼續(xù)升高，如：KZ-3、KZ-4、KZ-15、KZ-18、KZ-19、KZ-21、KZ-22；有的菌株解鉀能力降低，如：KZ-1、KZ-2、KZ-6、KZ-26；KZ-7和KZ-9菌株甚至已失去了解鉀活性；KZ-8菌株的解鉀能力仍保持不變。

圖3 定殖后解鉀能力測試Fig.3 Test of potassium-releasing ability after colonized

2.5 解鉀菌株的鑒定

2.5.1 基因組DNA的提取

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)提取紅棗根際解鉀菌株基因組DNA，用核酸濃度測定儀測定DNA提取液的OD260、OD280值，計算OD260/OD280值和DNA濃度[12]。算得DNA提取液的OD260/OD280值均處于1.7～2.1之間，質(zhì)量濃度為75～450 ng/μL，說明提取的DNA純度和濃度較高。

2.5.2 解鉀細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

將硅酸鹽細(xì)菌菌株的16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1％瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖4所示。利用引物16Sf/16Sr擴(kuò)增出的26株硅酸鹽細(xì)菌的16S rDNA片段序列長度在1 500bp左右，符合常規(guī)的16S rDNA序列長度。

圖4 解鉀細(xì)菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖片F(xiàn)ig.4 Electrophoretogram of the PCR ampli fi cation products of 16S rDNA gene from potassium-releasing bacteria

2.5.3 16S rDNA基因序列分析

將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物，送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序，共獲得14條解鉀細(xì)菌16S rDNA序列，有12株細(xì)菌(KZ-5、KZ-10、KZ-11、KZ-12、KZ-13、KZ-14、KZ-16、KZ-17、KZ-20、KZ-23、KZ-24) 的 16S rDNA 測序不成功。采用ClustalX1.8軟件進(jìn)行拼接，使用NCBI的BLAST功能，與GeneBank(核酸序列數(shù)據(jù)庫)中已有序列進(jìn)行比對，比對結(jié)果如表2所示。

由表2可知，經(jīng)16S rDNA鑒定解鉀細(xì)菌有4個屬，分別為節(jié)桿菌屬Arthrobacter、芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、沙雷氏菌屬Serratia。

表2 解鉀細(xì)菌16S rDNA序列BLAST結(jié)果Table 2 The BLAST resule of decomposing potassium bacteria 16S rDNA sequence

3 討論與小結(jié)

解鉀菌又稱硅酸鹽細(xì)菌，能夠分解土壤中硅酸鹽類礦物，可以使難溶于水的鉀轉(zhuǎn)化為植物可吸收利用的有效鉀，同時還能夠分解土壤中的無效磷成為有效磷[13]。現(xiàn)今，國內(nèi)外學(xué)者相繼開展高效解鉀菌株的分離培養(yǎng)，試圖利用其改善土壤中缺乏鉀的狀況。

目前發(fā)現(xiàn)的鉀礦物分解菌主要有：芽孢桿菌屬Bacillussp.、假單胞菌屬Pseudomonassp.、固氮菌Azotobactersp.伯克霍爾德菌Burkholderiasp.和農(nóng)桿菌Agrobacteriumsp.等[14-17]。本研究中最終篩選出14株具有較高解鉀能力的菌株，它們分屬4個屬，分別為節(jié)桿菌屬Arthrobacter，芽孢桿菌屬Bacillus、假單胞菌屬Pseudomonas、沙雷氏菌屬Serratia，這可能是因為不同地區(qū)的土壤或不同植物的根際硅酸鹽種群分布存在著一定的差異。

本研究中選取紅棗根際土壤，在實驗室富營養(yǎng)條件下初步進(jìn)行篩選，經(jīng)過人工誘變獲得高效解鉀菌株，在大田自然條件下進(jìn)行定殖，菌株在自然條件下受到土壤肥力、水分、溫度以及其它土壤微生物的影響。

[1] 原勤勤,文亞峰,劉 儒,等.棗優(yōu)良品種親緣關(guān)系的ISSR分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2012，30(1):56-61.

[2] 中國科學(xué)院新疆綜合考察隊,中國科學(xué)院植物研究所.新疆植被及其利用[M].北京:科學(xué)出版社,1978.

[3] 張艷紅,陳兆慧,王德萍,等.紅棗中氨基酸和礦質(zhì)元素含量的測定[J].食品科學(xué),2008,29(1):263-266.

[4] 蔣先軍,黃昭賢,謝德體.硅酸鹽細(xì)菌代謝產(chǎn)物對植物生長的促進(jìn)作用[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2000,22(2):116-119.

[5] 周毅峰,羅云霞,劉華中,等.解鉀菌的篩選[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版,2009,27(3):285-288.

[6] 別運清,胡正嘉.硅酸鹽細(xì)菌幾種功能的研究[J].襄樊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報,2002,1(1):12-15.

[7] 王 偉,李 佳,劉金淑,等.硅酸鹽細(xì)菌菌株的分離及其解鉀解硅活性初探[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(17):7889-7891.

[8] 賀積強(qiáng),李登煜,張小平,等.硅酸鹽細(xì)菌的研究進(jìn)展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,1999,(S1):102-108.

[9] 占新華,徐陽春,蔣廷惠.硅酸鹽細(xì)菌的生物效應(yīng)和根際效應(yīng)[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2003,22(4):412-415.

[10] 馮 纓,嚴(yán) 成,尹林克.新疆植物特有種及其分布[J].西北植物學(xué)報,2003,23(2):263-273.

[11] 黃青云,陳金頂,任 濤,等.禽大腸桿菌耐藥標(biāo)記弱毒菌株O2(Norr，Chls)和 O78(Chls，Norr)的培育 [J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1997,18(2):89-92.

[12] 李鐵柱,杜紅巖,王 淋,等.杜仲C4H基因cDNA全長序列特征分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2014,01:164-166.

[13] 李阜棣.土壤微生物學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1996.

[14] 楊劍芳,黃明勇,李 楊,等.鹽堿土硅酸鹽細(xì)菌多樣性初步研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2010,26(20):193-199.

[15] 王 淋,烏云塔娜,劉慧敏,等.杜仲MVA途徑相關(guān)基因全長cDNA序列特征研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2014,34(1):94-102.

[16] 閆法領(lǐng),劉君昂,譚益民,等.馬尾松人工林林下植被恢復(fù)模式對土壤微生態(tài)的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2013,33(7):50-55.

[17] 李海龍,谷 潔,張宏斌,等.秦嶺山區(qū)硅酸鹽細(xì)菌的分離、篩選以及初步鑒定[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,20(4):194-199.