多花黃精嫩莖與根莖芽離體培養技術

周新華，曾滿生，肖智勇，李峰卿，周志蘭，鐘秋平

(1.中國林業科學研究院 亞熱帶林業實驗中心，江西 分宜 336600；2.宜春市林業科學研究所，江西 宜春 336000)

多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua是百合科黃精屬藥食同源的多年生草本植物，其根莖是我國傳統大宗藥材，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等功效[1-2]。多花黃精主要分布在四川、貴州、湖南、湖北、河南、江西、安徽、浙江、福建、廣東等省份，生長在林下、灌叢或山坡陰處，海拔500～2 100m[3]。在人工栽培中由于受種子收集難度大、發芽率低下、育苗周期長等因素影響，多花黃精通過有性繁殖的方式無法滿足生產需要。而無性繁殖作為保持母本優良性狀和快速繁育的重要手段，可有效地解決優良種源性狀固定和利用這一難題。與扦插、嫁接等常規無性繁殖方法相比，組織培養具有不受季節、取材數量等因素制約的優勢，可在短期內規模繁殖性狀穩定的優良種苗[4-5]。利用組培手段培育出來的種苗，不僅保持了母本的優良性狀、增加了繁殖材料、縮短了育苗周期，還可為建立優良苗圃繁育基地節省育苗成本。因此，開展多花黃精的離體組織培養和芽增殖技術研究非常有必要。

國內的相關研究集中于多花黃精的芽體外發生、根莖芽增殖和株體生根等組織離體培養技術[6-11]，結果表明不同外植體材料的組織部位、年齡和培養基成分是影響多花黃精組培成功與否的關鍵。植物材料組織培養按器官發生途徑，通常可分為器官直接發生途徑和器官間接發生途徑2種類型。直接發生途徑以芽為外植體，獲得的植株具有穩定性好、自然變異頻率低、適應性強和移栽成活率高等優點[12]。但芽增殖系數不高一直是制約多花黃精器官直接再生組織培養途徑的主要因素，因此探索提高芽的誘導和增殖效率是當前多花黃精組織培養過程中迫切需要解決的問題。

本試驗中以野生多花黃精的嫩莖和休眠芽為材料，進行植物組織器官直接發生的離體培養技術研究，探索適合大崗山山區野生多花黃精嫩莖和根莖芽增殖的最優培養基，以期為構建多花黃精高效、穩定的組織培養再生體系，規模化生產多花黃精組培苗提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以江西省分宜縣中國林業科學研究院亞熱帶林業實驗中心年珠林場大崗山山區選育的生長性狀表現優良的野生多花黃精為研究對象，選取嫩莖和休眠根莖芽2種外植體為研究材料。該批植株是于2010年從大崗山山區選育移栽到試驗基地的試驗材料，2012年底將多花黃精塊莖移至亞林中心生物工程部進行沙藏處理，方便取材，嫩莖取材約10cm作為外植體誘導材料，根莖芽從塊莖上切取新萌芽。

1.2 試驗方法

1.2.1 滅 菌

先用體積分數為75％酒精進行表面滅菌，然后采用15％次氯酸鈉和0.1％氯化汞進行深度滅菌，酒精滅菌處理時間為分別15、30s，次氯酸鈉和氯化汞滅菌處理時間分別為6、8、10min，滅菌采用多因素滅菌試驗設計，共計12個處理，每個處理重復3次。將取得的長約10cm的嫩莖材料，剪成長3～5cm(1～2節)的細段放入燒杯中，用洗潔精浸泡洗滌15min，然后用自來水沖洗1h以上。之后在超凈工作臺上進行滅菌試驗，處理完成后用無菌水沖洗4次以上，接入MS培養基中，30d后統計污染情況，并算出每個處理相應的無菌率。

無菌率=無菌瓶數/接種總瓶數。

1.2.2 嫩莖和根莖芽誘導

選用無外源激素的MS、White和H等3種基本培養基開展嫩莖和根莖芽的萌發試驗，每個處理重復3次。滅菌后的嫩莖和根莖芽分別接種在上述3種培養基中，45d后統計萌發的芽數，并計算平均萌發芽數。

平均萌發芽數=萌發的總芽數/接種的總瓶數。

1.2.3 不定芽誘導

MS培養基的硝酸鹽含量較其它培養基高，被廣泛應用于植物的器官、花藥、細胞和原生質體培養，效果較好[13]。以MS培養基為基礎培養基，試驗處理采用萘乙酸(NAA)和激動素(KT)2種植物生長激素，0.5～2.0mg/L不同質量濃度激素處理的雙因素試驗，共計4個處理，每個處理重復3次。將根莖芽剝去外面2～4層后，洗潔精浸泡洗滌15min，自來水沖洗1h以上，超凈工作臺上用體積分數為75％的酒精處理15s，用無菌水沖洗3次，用0.1％的氯化汞處理10min，用無菌水沖洗4次以上，剝去外面1層，接種在不同處理的MS培養基中。45d后統計萌發不定芽的數量，并計算平均增殖數。

平均增殖數＝萌發不定芽總數/接種總芽數。

1.2.4 培養條件

組培室培養條件為：溫度控制在(24±2)℃，光照強度控制在1 500～2 000 lx，每天光照時間12h，濕度控制在70％左右。

1.3 數據分析與處理

采用SPSS18.0統計分析軟件進行方差分析和多重比較。多重比較采用顯著系數0.05上的Duncan多范圍檢驗，所有檢驗數據都在同一量綱上進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌處理對外植體滅菌效果的影響

先以酒精處理進行表面滅菌，然后以次氯酸鈉或氯化汞處理進行深度滅菌的混合處理滅菌方法，不同外植體滅菌處理的滅菌效果不同(見表1)。表1中結果顯示，75％的酒精處理30s、0.1％氯化汞處理10min外植體滅菌效果最好，無菌率高達73.2％；其次是75％的酒精處理30s、0.1％氯化汞處理8min，外植體消毒無菌率達到64.8％。氯化汞是一種有劇毒的重金屬殺菌劑，能使蛋白質變性，使酶失活，在常用消毒劑中其滅菌效果最好[12]，本試驗中外植體材料來源于地下部，帶有大量的細菌和真菌，使用其它消毒劑恐難以達到較好的滅菌效果。但氯化汞的重金屬殘留會對植物造成傷害，廢液亂棄也會對環境造成危害，故在使用氯化汞進行滅菌時應增加對外植體的沖洗次數(最好6次以上)，廢棄液采用硫化鈉處理，防止環境污染。

表1 不同滅菌處理的滅菌效果?Table 1 Effect of different sterilization treatments

2.2 不同培養基對腋芽萌發的影響

外植體滅菌后接種在無外源激素的MS、White和H 3種基本培養基上進行腋芽萌發試驗，培養45d后，統計外植體萌發的腋芽數，并計算單個外植體的平均萌發數，結果見表2。表2中結果顯示，MS培養基上的外植體腋芽萌發最好，平均萌發數嫩莖1.0個、根莖芽1.5個；其次是White培養基，腋芽平均萌發數嫩莖0.5個、根莖芽1.0個。就外植體不同取材部位而言，根莖芽的萌發能力要明顯大于嫩莖部位，這與外植體材料不同部位自身的萌發能力有關。不同外植體萌發的腋芽見圖1A和圖1B。

2.3 不同激素質量濃度對不定芽誘導的影響

將滅菌后的根莖芽接種在含有不同質量濃度激素的MS培養基上，培養45d后，觀察統計誘導不定芽數量，并計算平均單個根莖芽上誘導出的平均不定芽數，統計結果見表3。試驗結果表明，NAA和KT單獨使用時，以NAA 2.0mg/L和KT 2.0mg/L的不定芽誘導效果最好，2個處理單個根莖芽能誘導出不定芽的數量分別為2.2和2.7個。在此基礎上，保持NAA和KT激素質量濃度在同等水平，進行NAA和KT的組合對根莖芽誘導試驗，激素組合NAA 1.5mg/L＋KT 1.5mg/L對根莖芽的誘導效果最佳，單個根莖芽的平均不定芽誘導數達6.6個，使用NAA和KT激素組合均比單獨使用NAA和KT對不定芽的誘導效果要好。激素組合誘導出的不定芽見圖1C和圖1D。

表2 不同培養基中外植體萌發結果Table 2 Explants germination status in different media

3 結論與討論

3.1 滅菌方法的選擇

為方便試驗獲取嫩莖和根莖芽材料，于11月底將黃精根莖從苗圃地中挖起移至室內沙藏處理，沙藏處理時間長短和沙粒的滅菌與否對外植體滅菌后的污染率影響較大。由于本試驗中外植體材料長時間埋藏在沙中，不可避免取材帶有大量的細菌和真菌，這是獲取無菌組織培養材料的一大障礙。為克服這一困難，本試驗中在獲取無菌材料時，先將材料用洗潔精浸泡洗滌，然后用自來水沖洗1h以上，轉移到超凈工作臺上后用75％的酒精進行表面滅菌，再選用消毒能力最強的0.1％氯化汞進行滅菌處理效果較好。為減少重金屬殘留對外植體材料的毒害作用，在滅菌之后用無菌水沖洗6次以上較好。

表3 MS培養基上不同質量濃度激素處理對不定芽誘導的影響Table 3 Effect of different mass concentration treatments of hormones in MS medium on adventitious buds induction

圖1 多花黃精組織培養腋芽萌發和不定芽誘導過程Fig.1 Axillary bud germination and adventitious bud differentiation process in tissue culture of P.cyrtonema

3.2 基本培養基和材料部位的選擇

在組織培養過程中，外植體分化和生長受多種因素的綜合影響，其中培養基的成分和含量以及外植體的取材部位選擇，對組織培養植物的發生過程和生長形態均有著顯著影響。本試驗中通過對外植體在無外源激素的MS、White、H 3種基本培養基上的腋芽萌發試驗，得出MS基本培養基最有利于外植體材料腋芽的萌發；通過對嫩莖、根莖芽在MS、White、H培養基上的腋芽萌發試驗，得出根莖芽的萌發能力要顯著好于嫩莖的萌發能力。因此，以MS為基本培養基、根莖芽為材料有利于多花黃精組織離體培養技術的探索。

3.3 不同激素質量濃度的選擇

芽增殖過程中，最適合腋芽萌發的基本培養基是MS培養基。休眠芽是誘導不定芽的理想材料之一，芽誘導的效果受到材料基因型、樹齡、培養基、培養條件等多方面因素影響[14-18]。本試驗中通過對根莖芽在含有不同質量濃度NAA和KT的MS培養基上的不定芽誘導試驗，最終確定最適不定芽誘導的培養基為MS＋NAA 1.5mg/L ＋KT 1.5mg/L。

在植物組織離體培養過程中，影響離體組織生長發育的因素較多。本試驗中著重對基本培養基、外植體選材部位和外源激素種類和質量濃度對黃精植物組織離體材料的生長和增殖情況的影響進行了初步探索。在試驗設計上，由于試驗規模和時間限制，未開展對培養溫度、光照以及其它基本培養基和多種不同激素及其質量濃度組合對多花黃精生長和芽增殖的影響探索，在后續研究中可以采用正交設計或均勻設計方法等，利用快速高效的手段開展進一步的探索。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典:一部[M].北京:化學工業出版社,2005:275-287.

[2] 樊艷榮,陳雙林,楊清平,等.毛竹林下多花黃精種群生長和生物量分配的立竹密度效應[J].浙江農林大學學報,2013,30(2):199-205.

[3] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第十五卷[M].北京:科學出版社,1978:64-65.

[4] 李魁鵬,王亞珍,孫曉梅,等.雜種落葉松嫩枝離體培養與芽增殖研究[J].林業科學研究,2013,(專刊):82-86.

[5] 唐佳佳,尚旭嵐,洑香香.黑荊樹愈傷組織誘導、增殖與分化[J].中南林業科技大學學報,2014,34(9):38-43.

[6] 徐紅梅,趙東利.植物生長調節劑對多花黃精芽外植體發生過程中性狀的影響[J].中草藥,2003,34(9):855-858.

[7] 劉紅美,方小波,夏開德,等.多花黃精組織培養快繁技術的研究[J].種子,2010,12(29):13-17.

[8] 徐忠傳,何俊蓉,周靜亞,等.6-BA濃度對多花黃精不定芽增殖的影響[J].安徽農業大學學報,2006,33(1):105-107.

[9] 周建金,羅曉鋒,葉 煒,等.多花黃精組培快繁技術研究[J].福建農業科技,2012,(9):59-61.

[10] 周建金,羅曉鋒,葉 煒,等.多花黃精組織培養技術[J].三明農業科技,2012,(3):27-30.

[11] 張旺凡,馮務群,晁 志,等.黃精多倍體誘導初報[J].中國種業,2011,(1):48-49.

[12] 唐 巍,歐陽藩,郭仲深,等.針葉樹體細胞無性系研究和應用進展[J].生物工程進展,1997,17(4):2-9.

[13] 王金剛,張 興.園林植物組織培養技術[M].北京:中國農業科學出版社,2008:22-24.

[14] 孔欣然,于雅慧,張 蓉,等.GA3、溫度、光照對薄皮木種子萌發的影響[J].經濟林研究,2014,32(1):117-120.

[15] 彭 兵,劉愛麗,何業華,等.荔枝莖段愈傷組織誘導與增殖研究[J].經濟林研究,2013,31(2):125-129.

[16] Thorpe T A,Harry I S,Kumar P P.Application of micropropagation to forertry[M].Micropropagation:Technology and Application,1990:311-336.

[17] Hosseyni N,Ozan A,Kaya Z.Basal nutrient and hormonal requirements for direct organogenesis of Cedrus libani A Rich[J].Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture,1999,36:53-56.

[18] Aderkas V P,Bonga J M.Influencing micropropagation and somatic embryogenesis in mature tree by manipulation of phase change,stress and culture environment[J].Tree Physiol,2000,20:921-928.