毛菍莖段離體培養

伍成厚，鄭慈真，代色平，孫砥柱，劉 文，黃春燕

(廣州市園林科學研究所，廣東 廣州 510405)

毛菍Melastoma sanguineumSims為野牡丹科野牡丹屬大灌木，分布于長江以南各省區，為海拔400m以下酸性土壤中常見植物[1]，全株或葉入藥，具解毒止痛、生肌止血等功效[2]。毛菍高1.5～3.0m，全株被長粗毛，葉卵狀披針形，開花期長，花朵碩大，花瓣粉紅色或紫紅色，果杯狀球形，密被紅色長硬毛，是優良的觀花和觀果植物，可作庭園孤植樹、群植或行道樹[3-6]。

關于毛菍的研究當前主要集中在藥效成分分析[7]、形態學觀察[8-9]和傳粉生物學[10]等方面，有關其組織培養的研究僅限于種子培養[11]。文中采用毛菍枝條進行離體培養，以期探索出一條高效的無性繁殖途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料取自廣州市園林科學研究所培育的2年生毛菍容器袋苗，植株生長健壯、無病蟲危害，已經開花結實。在2012年4～5月剪取當年生新梢作為試驗材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料消毒與接種

將枝條剪除葉片后浸泡在加有洗潔精的洗滌液中10～20min，用軟毛刷洗凈附著的塵土，再用自來水沖洗30min。在超凈工作臺上，將沖洗干凈的枝條用75％酒精浸潤30s，然后轉入0.1％的HgCl2溶液中消毒10min，再用無菌水沖洗5～6次后將枝條切成單芽帶節莖段，并迅速接到培養基上。啟動培養基為MS＋6-BA0.5mg/L＋NAA0.01mg/L，培養基添加精制白砂糖3％、卡拉膠0.51％，pH值5.8，121℃蒸汽滅菌20min。

1.2.2 芽的增殖

以離體萌發的腋芽進行芽的增殖試驗。增殖培養基為MS添加不同質量濃度的細胞分裂素(6-BA)、生長素(NAA或IBA)和活性炭，精制白砂糖3％、卡拉膠0.51％，pH值5.8。每個培養基接種10瓶，每瓶接種5株，45d后觀察芽的增殖效果。新芽的標準為芽點萌發并長出葉片。

新增芽數＝總芽數-接種芽數；

新芽增殖倍數＝新增芽數/接種芽數。

1.2.3 不定根的誘導

切取長度大于1cm的毛菍芽苗在1/2MS培養基上進行不定根的誘導。1/2MS培養基即MS基本培養基中大量元素質量濃度降低50％，添加不同質量濃度的NAA、IBA和活性炭，以及精制白砂糖2％、卡拉膠0.52％，pH值5.8。每個培養基接種10瓶，每瓶接種5株。接種后30d觀察試管苗的生長狀況，并計算生根率和平均根數。長度在0.2cm以上且直接從芽苗基部長出的根才計數，而從這些根上分化出來的側根統一不計數。

生根率＝(生根苗數/接種苗數)×100％；

平均根數＝根的總條數/長根苗數。

1.2.4 試管苗的移栽

試管苗在水簾溫室經過15～20d煉苗，用自來水沖洗干凈根部的培養基后移到72孔穴盤中栽植，基質采用進口泥炭，栽完后澆1次水，然后在水簾溫室內常規管理。移栽30d后觀察試管苗成活情況，計算移栽成活率。

移栽成活率＝(成活苗數/觀察苗數) ×100％。

2 結果與分析

2.1 毛菍芽的誘導和增殖

毛菍莖段離體培養后，切口處會產生輕微褐變，經過20～30d培養莖段腋芽和頂芽均可以萌發，在培養基MS＋6-BA0.5mg/L＋NAA 0.01mg/L上可以獲得無菌芽(見圖1A)。

圖1 毛菍莖段離體培養Fig.1 Stem segment in vitro culture in M.sanguineum

無菌芽經繼代培養后，在基部腋芽區域由于萌發眾多不定芽而形成芽叢(見圖1B),也有在基部切口處形成叢芽的(見圖1C)。芽的增殖方式除形成不定芽外，還可通過節間腋芽的萌發即誘導毛菍每個節間的2個腋芽萌發而得以實現(見圖1D)。

2.2 生長調節物質和活性炭對毛菍芽增殖的影響

毛菍無根苗在不加生長調節物質和活性炭的MS培養基(對照)上，新芽增殖較少，增殖倍數僅為0.5，新芽全部為莖節腋芽萌發而來，且有18.0％的芽苗長根(見表1)。

培養基添加細胞分裂素和生長素后，芽的增殖數量明顯增加。當NAA質量濃度為0.01mg/L時，隨著6-BA質量濃度從0.1mg/L提高到2.0mg/L芽的增殖倍數也相應地從1.4倍增至6.5倍，即芽的增殖倍數與6-BA的質量濃度呈現明顯的正相關性。6-BA與IBA0.01mg/L搭配使用也取得類似的培養效果(見表1)。雖然6-BA的質量濃度越高芽的增殖倍數也越大，但當6-BA質量濃度達到2.0mg/L時新增的芽苗葉片和莖細小，出現玻璃化苗，其形成的有效芽苗比率明顯降低。在MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.01mg/L培養基上芽的增殖倍數為5.9，而MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.01mg/L＋AC300mg/L培養基上增殖倍數僅為0.1，比對照的0.5倍還低，且有68.0％的無根苗長根，顯示培養基添加活性炭300mg/L，可以抵消6-BA對芽增殖的誘導效果。

表1 生長調節劑和活性炭對毛菍離體培養芽增殖的影響?Table 1 Effect of growth regulators and activated carbon on multiplication of buds in M.sanguineum

2.3 毛菍不定根的誘導

毛菍無根苗在MS基本培養基上有18.0％的芽苗長根，在1/2MS培養基上不定根的誘導率達到54.0％(見表2)，表明降低培養基鹽分濃度有利于毛菍不定根的誘導。

在1/2MS培養基添加生長素可以顯著提高不定根的誘導率。由表2可以看出，在添加了NAA0.1～0.5mg/L的培養基中毛菍不定根的誘導率均達到100％，平均根數也達到4～5條，并有較多側根的形成(圖1E)。IBA的誘導效果較NAA差，在添加了IBA0.1mg/L的培養基上生根率僅86.0％，根條數3.6，略低于NAA0.1mg/L處理中的3.9條。

在1/2MS＋NAA0.3mg/L培養基上添加活性炭300mg/L后，不定根的誘導率從100％降至46.0％，表明活性炭抑制了毛菍莖段根的誘導。但在MS＋6-BA1.0mg/L＋NAA0.01mg/L＋AC 300mg/L培養基上68.0％的毛菍無根苗長根(見表1)，顯示活性炭對毛菍長根有很好的誘導作用。前后2次試驗相互矛盾的結果揭示，活性炭對毛菍不定根的誘導之所以產生促進或抑制作用是因為活性炭吸附了培養基中的生長調節物質，并不是活性炭本身對根的誘導有抑制或促進的作用，即在生根誘導培養基加入300mg/L AC后由于活性炭吸附了生長素從而不利于不定根的誘導。

2.4 毛菍試管苗的出瓶移栽

毛菍試管苗根系發達，在水簾溫室內只需常規管理，移栽成活率超過95％(見表3)。試管苗移栽成活后，苗莖和葉柄由綠色變成紫紅色，葉片舒展，顯示旺盛的生命力(見圖1F)。

表2 生長素和活性炭對毛菍不定根誘導的影響?Table 2 Effect of auxins and activated carbon on adventitious root induction in M.sanguineum

表3 毛菍試管苗的移栽成活情況Table 3 Survival status of transplanted test-tube plantlets in M.sanguineum

3 討 論

野牡丹科植物全世界約240個屬，3 000余種，主要分布于世界各大洲熱帶或亞熱帶地區，本科植物中許多種類除可作藥用、食用外，多個屬種已被選育用于城市的園林綠化[12]。隨著其園林開發應用的發展，野牡丹科植物的組織培養日益受到人們的重視。利用帶芽莖段進行快速繁殖，因組培苗發生變異少，能保持野牡丹植株的開花性狀，對優良母株的快繁具有其它繁殖方式不可取代的優越性。野牡丹屬Melastoma的野牡丹M.candidum[13]、地 稔M.dodecandrum[13-15]、細葉野牡丹M.intermedium[16]、印度野牡丹M.malabathricum[17]、展毛野牡丹M.normale[18]和紫毛野牡丹M.penicillatum[19]，以及金錦香屬Osbeckia的朝天罐O.opipara[20]、肉穗草屬Sarcopyramis的肉穗草S.nepalensis[21]和蒂牡花屬Tibouchina的角莖野牡丹T.granulosa[22]等植物莖段離體培養研究已獲得成功，而毛菍尚未見此類報道。毛菍為異花授粉植物，長期異花授粉導致毛菍的基因型高度雜合，使毛菍實生苗個體表現型之間產生差異，可以從中篩選性狀優良的單株，本試驗中建立的莖段培養技術對于毛菍優株的快繁并實現無性系化具有很好的應用前景。

本試驗中毛菍芽的增殖有2種方式，一是在莖節基部腋芽區域或切口處形成不定芽并發育成叢生芽(見圖1B、C)；另一種方式是節間腋芽萌發，即每個莖節的2個腋芽萌發實現芽的增殖(見圖1D)。誘導節間腋芽萌發需要的激素質量濃度較低，在低質量濃度的6-BA(0～0.3mg/L)條件下即可誘導腋芽萌發，其增殖倍數在添加了BA 0.3mg/L和NAA0.01mg/L的培養基上達到3.7，在添加BA0.3mg/L和IBA0.01mg/L的培養基上為3.6倍。誘導莖節基部不定芽形成需要較高質量濃度的6-BA(0.5～2.0mg/L)，在高質量濃度6-BA條件下節間腋芽也基本萌發，并由此獲得較高的增殖倍數。由于低質量濃度水平的6-BA可能發生變異的概率很低，從保持母株優良特性的角度出發在芽增殖階段盡可能降低細胞分裂素質量濃度是非常必要的。在BA0.3mg/L時芽的增殖達到3倍以上，已經基本可以滿足快繁對芽增殖倍數的要求，因此毛菍芽的增殖方式以選擇誘導腋芽萌發較為適宜。

在木本植物組織培養中常使用到活性炭以減輕褐變。在荔枝Litchi chinensis[23]、核桃[24]的莖段離體培養中，添加活性炭對抑制褐變有一定效果，在樟子松Pinus sylvestrisvar.mongolica[25]的成熟胚培養中附加活性炭對不定芽的生長與伸長有良好的促進作用。在油茶Camellia oleifera組培試驗中添加活性炭有利于幼苗的生長[26]，但不利于小孢子的離體發育[27]。在肉穗草長根試驗[21]中培養基添加1％活性炭時生根率達到90％以上，在本試驗中，添加活性炭對毛菍不定芽的增殖和不定根的分化均產生不利影響，因此毛菍組織培養中活性炭應謹慎使用。

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