利用往返電泳法(R-PAGE)檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒技術要點

邱彩玲

（1.黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030)

利用往返電泳法(R-PAGE)檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒技術要點

邱彩玲1,2*

（1.黑龍江省農業科學院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.東北農業大學，黑龍江哈爾濱150030)

目前國內普遍采用的往返電泳法是檢測馬鈴薯類病毒的主要方法之一，但該方法存在靈敏度低，重復性差等問題。因此，針對上述問題總結出一些技術要點：（1）保證植物生長環境及正確取樣；（2）提高凝膠中RNA的濃度和質量；（3）控制好反向電泳的溫度和時間；（4）及時更換染色液。

往返電泳；馬鈴薯類病毒；技術要點

馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（Potato spindle tuber viroid,PSTVd）是第一個發現的類病毒，其病原是一種比一般病毒小得多的低分子量物質[1,2]，具有高度的侵染性，極易通過接觸、農具、衣物和切刀等進行汁液傳播，也可通過花粉和子房傳到種子中。據報道，PSTVd還可以通過某些昆蟲傳播，如:綠盲蝽蟓、蚱蜢和馬鈴薯甲蟲等，傳播途徑十分廣泛。PSTVd強系可引起減產60%，弱系減產20%～35%，造成較大經濟損失[3]。馬鈴薯紡錘塊莖類病毒是威脅中國馬鈴薯生產的重要病害，該病害在中國從南到北均有發生，并呈逐年上升趨勢，在北部的馬鈴薯主產區嚴重危害馬鈴薯生產和實生種子的品質，是種薯生產和實生種子利用中亟待解決的問題[4]。

往返電泳（R-PAGE）技術的原理及方法是：類病毒分子在自然和變性條件下電泳遷移率存在明顯不同，變性所引起類病毒核酸的環狀結構使其電泳遷移率明顯慢于相同分子量的其它線性RNA分子，第一次電泳在非變性條件下，類病毒RNA的棒狀核酸同寄主核酸分離出來,第二次電泳是在變性條件下變換電極，此時，類病毒核酸由棒狀變成單鏈環狀，比同樣大小的核酸遷移慢，因此，類病毒RNA會產生一條明顯的帶，據此，結合可靠靈敏的銀染色技術測定類病毒。R-PAGE的優點是操作簡單，要求的實驗條件比較簡單，一般的實驗室都能滿足，可以普遍采用。然而，R-PAGE方法的靈敏度不及NASH和RT-PCR法，并且重復性不好，因此，筆者通過一系列的方法對該技術進行了改進，以期提高R-PAGE的靈敏度和重復性，確保檢測結果的準確可靠。

1 保證植物生長環境及正確取樣

由于馬鈴薯類病毒受溫度和光照的影響，因此，試管苗和溫室中種植的植株的生長環境應不低于18℃（最好高于20℃），并至少每天16 h光照，試管苗應在培養4～6周后，莖高達到5 cm后取樣，整株取樣。作為陰性對照的試管苗應在溫室種植一段時間后，使之生長充分，于開花前取樣，應取頂部充分展開的葉片[5]。

2 提高凝膠中RNA的濃度和質量

2.1 確保RNA提取質量

在日常工作中總結出以下幾點：（1）在RNA提取過程中，加入液氮可以迅速使細胞裂解，充分釋放出RNA，從而提高RNA提取效率；（2）操作盡可能在冰上進行，速度要快，盡量減少RNA提取的時間；（3）對試驗中涉及的器皿、耗材等進行處理，避免RNA酶降解。雖然PSTVd的結構比較穩定，與一般的RNA相比不易降解，但嚴格的操作對于確保試驗成功仍然是必不可少的重要環節。

2.2 提高RNA濃度

不言而喻，回溶溶液的多少直接影響著樣品中RNA的濃度，因此，在許可的范圍內減少回溶溶液可以提高RNA濃度，提高檢測效率。另外，使用大量樣品提取RNA也可以取得很好的效果。

2.3 增加上樣量

凝膠中RNA的總量越多，就越容易檢測到含量較低的馬鈴薯類病毒，提高檢測的效果。因此，在適當范圍內，應盡可能多的加入待檢RNA樣品，以提高檢測的效率。

3 控制好反向電泳的溫度和時間

由于類病毒在自然條件下呈棒狀高度配對的狀態，而在高溫（70～80℃）條件下變性，由棒狀變成環狀，致使在丙烯酰胺中的遷移率減慢，從而通過兩次電泳將類病毒的核酸帶與寄主中的其他核酸分離出來。因此，必須嚴格控制反向電泳的溫度，避免類病毒復性或變性不充分，使反向電泳的類病毒遷移率增加，與寄主核酸區分不明顯，影響檢測效率；然而，溫度也不能過高，否則高溫對凝膠有損害，使凝膠變形，影響馬鈴薯類病毒的檢測。

4 及時更換染色液

為了AgNO3染色液可以重復利用，降低成本、減少工作量，一般都重復使用，但不宜使用的次數過多，否則隨著AgNO3濃度的降低，染色效果會下降，甚至可以出現假陰性，因此，當AgNO3溶液中出現較多的沉淀時，應適時更換染色液，以確保染色效果，使陽性樣品清晰的顯示出來。

由于馬鈴薯類病毒可以通過接觸、昆蟲、種子等多種途徑傳播，因此，該病害必須要嚴格控制，嚴把種薯關。另外，由于目前沒有有效的方法脫除，且不能通過藥劑防治，因此，預防馬鈴薯類病毒是馬鈴薯生產中亟待解決的大問題，而目前解決的辦法只有嚴格檢測才能從根本上控制該病害。所以，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒病的檢測技術對于中國脫毒種薯生產、馬鈴薯產業的發展都至關重要。

[1]田波,張秀華,夏遠南.我國馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的初步研究[J].病毒學集刊,1982,1(1):119-122.

[2]Diener T O.Potato spindle tuber'virus':a replicating low molecular weight RNA[J].Virology,1971,45(1):411-428.

[3]程天慶.馬鈴薯栽培技術[M].2版.北京:金盾出版社,1996: 123.

[4]白艷菊,李學湛,呂典秋,等.用NASH方法檢測馬鈴薯紡錘塊莖類病毒[J].雜糧作物,2001,21(3):42-43.

[5]PM 7/33(1).Diagnostic protocols for regulated pests,potato spindle tuber pospiviroid[S].Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 34, 257-269.

Technical Points of Return-polyacrylamide Gel Electrophoresis(R-PAGE)on Detection of Potato Spindle Tuber Viroid(PSTVd)

QIU Cailing1,2＊
(1.Virus-free Seedling Research Institute,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin,Heilongjiang 150086,China;
2.College of Agronomy,Northeast Agricultural University,Harbin,Heilongjiang 150030,China)

At present,return-polyacrylamide gel electrophoresis(R-PAGE)is a commonly used method for potato spindle tuber viroid(PSTVd)detection in China.But,there are some drawbacks in this technique,such as low sensitivity and poor repeatability.In response to the problems mentioned above,some technical points were pointed out based on the author's experience for PSTVd detection:(1)optimization of plant growth environments and proper sampling;(2)increasing the concentration and quality of RNA in the gel;(3)the control of temperature and time in reverse electrophoresis;and(4) replacingthestainingsolutiontimely.

return-polyacrylamide gel electrophoresis(R-PAGE);potato spindle tuber viroid(PSTVd);technical point

S532

B

1672－3635（2014）04-0233-02

2014-06-14

哈爾濱市應用技術研究與開發項目（2013AE6AW059）；現代農業產業技術體系專項資金資助項目（CARS-10-P14）。

邱彩玲（1976-），女，博士研究生，主要從事馬鈴薯病害檢測技術研究。

邱彩玲，E-mail:279145673@qq.com。