桑黃總黃酮含量及其體外抗氧化活性研究*

劉 凡，龐道睿，鄒宇曉，廖森泰，肖更生

(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610)

桑黃總黃酮含量及其體外抗氧化活性研究*

劉 凡，龐道睿，鄒宇曉，廖森泰**，肖更生

(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東省農產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510610)

桑黃；黃酮含量；抗氧化活性

桑黃又名桑臣、桑黃菇、桑耳等，是一種大型珍貴藥用真菌，主要寄生于桑、楊、松、樺等樹的樹干上，在我國東北、華北、西北等地均有分布。桑黃(Phellinussp.)屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、針層孔菌屬(Phellinus)的真菌，具體又可以分為火木層孔菌(Igniarius)、鮑氏層孔菌(Baumii)、裂蹄層孔菌(Linteus)、瓦尼木層孔菌(Vaninii)等多個種[1]。

桑黃的藥用最早記載于《本草綱目》，“利五臟，宣腸胃氣，排毒氣”。傳統中醫認為桑黃味微苦，性寒，歸肝、腎經，可治療崩漏帶下，脾虛泄瀉等癥[2]。現代藥理學研究表明，桑黃具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、降血脂[5]、增強免疫力[6]等功效，是國際公認的最佳抗癌真菌之一[7]。

雖然目前對桑黃的研究主要集中在發酵條件優化[8，9]、桑黃多糖的制備及其活性研究[10-14]以及人工栽培[15]等方面。但對桑黃黃酮的研究則多集中在制備工藝優化[16-18]，關于桑黃黃酮的活性研究近年來也在逐漸興起[19-21]。

本文以不同來源的桑黃子實體和桑黃液體發酵菌絲體為材料，測定其總黃酮含量，評價其體外抗氧化活性，分析兩者相關性，并比較桑黃液體發酵菌絲體與桑黃子實體在總黃酮含量和抗氧化活性方面的差異，旨在為進一步開發和利用桑黃資源，特別是液體發酵桑黃資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生桑黃SH-1(Phellinusigniarius)，寄生于松樹，購自吉林；野生桑黃SH-2(Phellinuslinteus)，寄生于桑樹，購自云南；人工代料栽培桑黃SH-3(Phellinusbaumii)，購自黑龍江；人工代料栽培桑黃SH-4(Phellinusigniarius)，購自安徽；人工椴木栽培桑黃SH-5(Phellinusbaumii)，購自安徽。液體發酵培養桑黃SH-6，自行培養。桑黃菌種(Phellinusigniarius)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

種子培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)；液體發酵培養基：馬鈴薯浸出液30 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.2 g·L-1、酵母膏21 g·L-1、KH2PO41 g·L-1，pH自然。

總抗氧化活性(T-AOC)試劑盒、清除·OH試劑盒、清除O2-·試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司。 乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器設備

HH-4電熱數字顯示恒溫水浴鍋，上海金忠科學儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫療設備廠；DH300電熱恒溫培養箱，上海佳勝實驗儀器有限公司；PHS-3C精密pH計，上海雷磁儀器廠；EYELA N-1100旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；UV-1700紫外分光光度計，日本島津。

1.3 實驗方法

1.3.1 桑黃菌絲體的制備

無菌條件下，用打孔器打取桑黃活化菌種塊，接入含有100 mL液體培養基的三角瓶(250 mL)中，于120 r·min-1、25℃搖床培養7 d。將已生長好的菌絲轉接入含有400 mL液體培養基的三角瓶(1 000 mL)，于120 r·min-1、25℃繼續搖床培養10 d。將桑黃液體發酵物抽濾，取菌絲體。

1.3.2 桑黃提取物的制備

各桑黃子實體及發酵菌絲體于60℃恒溫干燥，粉碎，過60目篩，備用。

稱取各桑黃樣品粉末1 g，加入30 mL甲醇，于40℃恒溫水浴12 h后，超聲(60 Hz，40℃)提取30 min，過濾，收集濾液。殘渣按上述操作重復提取2次。合并濾液，40℃減壓濃縮，定容到25 mL，4℃保存，備用。

1.3.3 總黃酮含量測定

桑黃提取物總黃酮含量測定采用 Al(NO3)3-NaNO2分光光度比色法測定。總黃酮含量以每克桑黃樣品干物質中含有的總黃酮質量計。測定3次取平均值[22]。

1.3.4 體外抗氧化活性評價

總抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity，T-AOC)測定采用Fe3+還原試劑盒，參照試劑盒的測定方法，測定3次取其平均值，按以下公式計算其抗氧化活力(T，U·g-1)，公式為：

T=[(OD1-OD)0.01]30 ×(VV1)×N

式中：OD1表示測定管OD值；OD表示對照管OD值；V表示反應液總體積(mL)；V1表示取樣量(mL)；N表示樣品稀釋倍數。

清除羥自由基(·OH)能力(Scavenging Hydroxyl Radical Capacity，SHRC)測定，采用Fenton反應試劑盒，參照試劑盒的測定方法，測定3次取其平均值，按以下公式計算其抗氧化活力(S，U·g-1)，公式為：

S=(OD-OD1)(OD2-OD3)×M×(1V1)×N

式中：OD表示對照管OD值；OD1表示測定管OD值；OD2表示標準管OD值；OD3表示空白管OD值；M表示標準管濃度；1表示1 mL；V1表示取樣量(mL)；N表示樣品稀釋倍數。

S1=(OD-OD1)(OD2-OD3) ×M×1000×N

式中：OD表示對照管OD值；OD1表示測定管OD值；OD2表示標準管OD值；OD3表示空白管OD值；M表示標準管濃度；1 000的單位是mL；N表示樣品稀釋倍數。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 不同來源桑黃的總黃酮含量測定比較

對6種不同來源的桑黃提取物總黃酮含量進行了測定，結果如圖1所示。

由圖1結果可知，不同來源的桑黃總黃酮含量存在明顯差異。3種人工栽培桑黃子實體的總黃酮含量比較接近，2種野生桑黃子實體的總黃酮含量存在顯著差異。在所有供試樣品中，桑黃SH-2的總黃酮含量最高，達到61.33 mg·g-1，而液體發酵培養的桑黃菌絲體SH-6的總黃酮含量相對較低，為27.19 mg·g-1。這可能是由于野生桑黃的生長環境差異較大，而人工培養桑黃的環境控制條件相近所造成的。此外，桑黃菌種的差異，以及子實體和菌絲體的差異，也可能是導致不同樣品桑黃總黃酮含量差異的原因。

2.2 不同來源的桑黃體外抗氧化活性比較

6種供試桑黃的體外抗氧化活性測試結果如圖2～圖4所示。

由圖2～圖4結果可以看出，不同來源的桑黃，其體外抗氧化活性存在明顯差異。野生桑黃子實體的體外抗氧化能力普遍較強，特別是桑黃SH-2表現尤為突出。桑黃SH-2的體外總抗氧化能力(T-AOC)和清除超氧陰離子自由基能力(SSARC)在所有供試樣品中最強，分別達到589.86 U·g-1和100.44 U·g-1。清除羥自由基能力(SHRC)最強的為桑黃SH-1，達到 3 060.41 U·g-1，桑黃SH-2次之，為 2 748.64 U·g-1。綜合而言，野生桑黃(SH-1、SH-2)體外抗氧化活性最強，液體發酵培養的桑黃菌絲體體外抗氧化活性相對較弱，人工代料或椴木培養的3種桑黃樣品體外抗氧化活性表現相近，相互間差異不明顯。

2.3 桑黃體外抗氧化活性與其總黃酮含量之間的相關性分析

采用SPSS 17.0 軟件分別對桑黃體外總抗氧化能力、清除羥自由基能力、清除超氧陰離子能力與其總黃酮含量之間的相關性進行了分析，結果見表1。

注：**表示在0.01水平上(雙側)顯著相關。

從表1可以看出，桑黃提取物的體外總抗氧化能力、清除羥自由基能力和清除超氧陰離子自由基能力，與其總黃酮含量之間的相關性都達到了極顯著水平(p<0.01)，表明黃酮類化合物是桑黃抗氧化活性的重要物質基層。相較于抗氧化活性的測定，總黃酮含量的測定更為簡便，由此認為，在鑒定桑黃藥材品質時，可通過檢測桑黃總黃酮含量來評價其抗氧化作用。

3 結論

桑黃是目前國際社會公認抗腫瘤效果最好的珍稀菌類之一。但由于野生桑黃受其特殊生理狀態和復雜生長環境的制約，在自然界中形成的桑黃子實體很少，這使得對桑黃的研究受到了限制，也制約了桑黃產品的進一步研制和開發，遠不能滿足人們的需求。

通過本試驗可以發現，野生桑黃在總黃酮含量及體外抗氧化活性方面具有一定優勢，其活性物質含量(黃酮)及生理活性(抗氧化)均優于人工栽培及液體發酵桑黃樣品。但野生桑黃資源的稀缺性注定了其研究、應用的局限性。而在供試桑黃樣品中，人工栽培桑黃樣品亦含有較豐富的黃酮類化合物，表現出較強的體外抗氧化活性，說明人工栽培桑黃子實體具有一定的開發潛力，可以彌補野生桑黃資源不足的缺憾。此外，液體發酵桑黃菌絲體樣品雖然在總黃酮含量及體外抗氧化活性方面不如野生桑黃及人工栽培桑黃子實體，但液體深層發酵培養具有周期短、產量高、成本低等特點[23]，通過液體發酵可以快速獲得大量桑黃菌絲體，可為桑黃資源的開發利用提供原料保障。

[1]張小青，戴玉成. 中國真菌志[M]. 北京：科學出版社，2005：117-191.

[2]江西新醫學院. 中藥大詞典[M]. 上海：上海科學技術出版社，1995.

[3]DONG Wei, NING Li, LU Weidong, et al. Tumor-inhibitory and liverprotective effects ofPhellinusigniariusextracellular polysaccharides[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 2009, 25(4): 633-638.

[4]LUNGM Y, TSAI JC. Antioxidant properties of polysaccharides from the willow bracket medicinal mushroom,Phellinusigniarius(L.) Quel. (Aphyllophoromycetideae) in submerged culture[J]. International Journal of Medicinal Mushrooms, 2009, 11(4): 383-394.

[5]ZOU Xiang, GUO Xia, SUN Min. pH control strategy in a shaken minibioreactor for polysaccharide production by medicinal mushroomPhellinuslinteusand its anti-hyperlipemia activity[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2009, 32(2): 277-281.

[6]謝麗源，張勇，彭衛紅，等. 桑黃胞內多糖免疫及抗氧化活性研究[J]. 食品科學, 2011, 32(9)：276-281.

[7]呂英華，王建芳，李玉平，等. 藥用真菌桑黃的研究進展[J]. 蠶業科學，2009，35 (1): 204-210.

[8]邵杰，羅建光，曾曉雄. 液體培養的桑黃胞外多糖發酵培養基成分的優化[J]. 食品科學, 2012, 33(3): 121-125.

[9]李翠翠，尉玉曉，郭立忠. 桑黃液體發酵培養基優化的初步研究[J]. 中國食用菌，2009，28(2)：46-48.

[10]郭俊平，趙述淼，馬姝萍，等. 桑黃多糖抗疲勞及耐缺氧實驗研究[J]. 中國食用菌，2012，31(3): 42-46.

[11]梁大勇，黃芳，趙晨，等. 桑黃粗多糖除蛋白及抗腫瘤活性[J]. 生物加工過程，2012，10(3)：56-60.

[12]孟慶龍，潘景芝，陳麗，等. 桑黃胞內及胞外多糖對荷瘤小鼠減毒增效作用的研究[J]. 中國中藥雜志, 2012(6):37-41.

[13]游慶紅，尹秀蓮. 響應面法優化桑黃多糖提取工藝研究[J]. 中國釀造，2010(5): 67-69.

[14]Hwang HJ, Kim SW, Choi JW, et al. Production and characterization of exopolysaccharides from submerged culture ofPhellinuslinteusKCTC 6190[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2003, 33(2): 309-319.

[15]杜萍，張春鳳，崔寶凱，等. 藥用真菌桑黃的人工栽培技術研究[J]. 中國食用菌，2009，28(3)：35-37.

[16]包海鷹，孫德立. 桑黃黃酮提取工藝的研究[J]. 時珍國醫國藥，2012，23(3)：516-518.

[17]夏國華，延茹，傅海珍，等. 超聲法提取桑黃總黃酮的工藝研究[J]. 江蘇大學學報：醫學版，2010，20(1)：40-41.

[18]胡金霞，楊焱，張勁松，等. 大孔吸附樹脂純化桑黃黃酮的研究[J]. 食品工業，2009 (3)：49-52.

[19]王欽博，楊焱，劉艷芳，等. 一年生和兩年生桑黃子實體的成分和生物活性[J]. 食用菌學報，2010，17(2)：71-75.

[20]回晶，李其久，邊媛媛，等. 桑黃總黃酮超聲提取工藝及其生物活性研究[J]. 食品科學，2010，31(24)：195-198.

[21]汪雯翰，王欽博，張勁松，等. 鮑姆木層孔菌(桑黃)脂溶性提取物對PC12神經元細胞衰老的保護作用[J]. 菌物學報，2011，30(5)：760-766.

[22]劉善新，賈元印. 不同生長時間桑枝中黃酮成分的比較[J]. 時珍國藥研究，1997，8 (1)：20-21.

[23]傅海慶，陳紹軍，駱文燦，等. 桑黃菌液體發酵培養基研究[J]. 中國食品學報，2007，7 (3)：58-63.

The Total Flavone Content and in Vitro Antioxidant Activity ofPhellinussp.

LIU Fan, PANG Dao-rui, ZOU Yu-xiao, LIAO Sen-tai, XIAO Geng-sheng

(Sericulture and Farm Produce Processing Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-Food science and Technology of Guangdong, GuangzhouGuangdong510610)

In order to investigate the material base of antioxidation and develop the medicinal function ofPhellinussp., the total flavone contents and in vitro total antioxidant capacity (T-AOC), scavenging hydroxyl radical capacity (SHRC) and scavenging superoxide anion radical capacity (SSARC) of extracts from six different varieties ofPhellinussp. were determined. Meanwhile, the dose-effect relationship between total flavonoid content and antioxidant activity was analyzed. The result indicated that there were significant differences among the total flavonoid contents of different varieties ofPhellinussp.. Each extract had good in vitro antioxidant activity, and the sample SH-2 was best. The correlation between total flavonoid content and T-AOC, SHRC, SSARC ofPhellinussp. reached extremely significant level (p<0.01).

Phellinus; Flavone content; Antioxidant activity

*項目來源：現代農業產業技術體系建設專項資金“桑資源加工利用崗位”(CARS-22-ZJ0502)；廣東省自然科學基金博士啟動項目“藥用真菌桑黃抗腫瘤活性代謝產物的研究”，編號：粵科基字[2010]3號；廣東省農科院院長基金“藥用真菌桑黃的液體深層發酵培養及其次級代謝產物研究”，編號：201006。

劉凡(1983-)，男，助理研究員，主要從事農產品加工研究。E-mail: liufan1234@126.com

**通信作者： 廖森泰，研究員，主要從事農產品加工、蠶桑資源綜合利用研究。E-mail: liaost@163.com

2014-01-18

S646.9

A

1003-8310(2014)02-0047-04