雙功能抗體藥物研究進展

李鋒，黎曉維，沈倍奮

抗體類藥物近 20年來蓬勃發展，目前全球上市的抗體藥物已經有 40 多個品種，其治療領域也從傳統的癌癥、自身免疫性疾病逐步擴展到抗感染和代謝性疾病等。2013年全球 10 大暢銷藥物中有 6 個是抗體類藥物，包括 3 個自身免疫病治療性藥物和 3 個抗腫瘤抗體。單克隆抗體發展的同時也開啟了對新結構、新功能抗體藥物的探索，以期進一步優化抗體藥物功能活性。抗體糖基化改造（afucosylation）、抗體-藥物偶聯（antibody drug conjugate，ADC）、雙功能抗體（bispecific antibodies，BsAb）等都是當前抗體藥物研發的熱點領域。單克隆抗體能夠特異性結合靶抗原上特定的表位，其優勢在于親和力高、專一性強。但傳統抗體僅結合單一靶點的單一表位，因此其療效受到一定限制。藥理學研究揭示，多數復雜疾病都涉及多種與疾病相關的信號通路，例如腫瘤壞死因子 TNF、白介素 6 等多種促炎癥細胞因子同時介導免疫炎性疾病，而腫瘤細胞的增殖往往是由多個生長因子受體的異常上調造成的。單一信號通路的阻斷通常療效有限，而且容易形成耐藥性。因此，開發能夠同時結合兩個不同靶點的雙功能抗體及其類似物，長期以來成為新結構抗體研發的重要領域。早期在免疫原性、結構穩定性以及抗體質量控制等方面的不足，限制了雙功能抗體的進一步的發展。近年來，上游基因工程抗體和下游生產工藝技術的改進，克服了傳統雙功能抗體的缺陷，從而推動了多類新型雙功能抗體進入臨床開發階段。目前主要在研的雙功能抗體從作用機制上可分為雙重信號阻斷型和抗CD3+T 細胞介導的雙功能抗體；從結構上可分為由單鏈抗體或 Fab 區組成的小型抗體和全抗體；從生產工藝上可分為原核或真核表達、單細胞內表達和雙細胞系表達結合體外裝配等方式。本文就雙功能抗體的最新進展進行簡要綜述。

1 雙功能抗體的結構與產生技術

雙功能抗體的研究始于 20 世紀 80年代單克隆抗體技術誕生后。最初的嘗試是將 2 株表達不同單克隆抗體的雜交瘤融合，構建 4 倍體雜交瘤。但是，兩株異源抗體的輕重鏈隨機裝配，理論上體系中會有 10 多種不同組合的抗體存在，為抗體純化和質控帶來了巨大的挑戰。目前唯一上市的雙功能抗體產品 catumaxomab（商品名 Removab）就是融合來自大鼠和小鼠分別表達抗 EpCAM 抗體和抗CD3 抗體的雜交瘤細胞株獲得的混合型雙功能抗體。利用種屬間抗體輕重鏈結合能力的差異以及種屬間抗體重鏈與親和層析介質蛋白 A 親和力的差異，catumaxomab 成功實現了高純度雙功能抗體的規模化生產。catumaxomab 的全抗體結構保留了抗體 Fc 結構域介導的生物學功能，抗體Fc 結合效應細胞 FcR 受體，Fab 雙臂分別結合 T 細胞表面 CD3 分子和癌細胞表面 EpCAM 受體，所以該項技術又稱為“三功能抗體”（Triomab）。盡管 catumaxomab 已于 2009年被歐盟批準上市用于治療 EpCAM 陽性腫瘤所引起的惡性腹水，但鼠源抗體的高免疫原性大大限制了其臨床應用[1]。

為了解決將兩個不同的人源化半抗體進行正確裝配的問題，研究者們設計開發了多種結構的雙功能抗體。首先是將兩個單鏈抗體（scFv）或者兩個 Fab 通過肽段 linker 鏈接，形成雙功能抗體片段。具有代表性的是德國 Micromet公司開發的 BiTE（bispecific T-cell engager）系列產品。該系列產品是將抗 CD3 單鏈抗體與不同抗腫瘤細胞表面抗原單鏈抗體通過肽段進行連接獲得的[2]。這類抗體結構的優點是分子量小、可以在原核細胞中表達、不需要考慮正確裝配的問題；缺點是由于沒有抗體 Fc 段，不能介導相應的生物學功能、半衰期短等，因而臨床應用受到一定限制。

另外一種可以保留抗體的 Fc 結構域的設計是在正常抗體輕重鏈的 N-末端分別再接入另一個抗體的 VL和 VH，通過兩個抗體可變區結合雙靶點，稱作 DVD（dual-variable domain）結構抗體。由于引入了額外的抗體可變區，其分子量大于正常 IgG 抗體[3]。

為了避免臨床上未知的免疫原性等副作用，雙功能抗體應盡量避免引入額外的連接肽段和結構域，采取接近正常抗體的結構。通過改造抗體 CH3 區的氨基酸序列，形成有利于異種半抗體相互配對的結構，可以在構成雙功能抗體的同時又盡可能地保持正常抗體的結構。較典型的是“杵臼”結構抗體（knob-in-hole），具體方法是將其中一個抗體的重鏈CH3 區 366 位體積較小的蘇氨基酸殘基 T 突變為體積較大的色氨酸殘基 W，形成突出的“杵”型結構；同時將另一個抗體重鏈 CH3 區 407 位較大的酪氨酸殘基 Y 突變成最小的丙氨酸 A，形成凹陷的“臼”型結構；利用“杵臼”結構的空間位阻效應實現兩種不同抗體重鏈間的正確裝配。由于抗體輕鏈通常對其結合活性影響較小，通過兩類抗體共用序列相同的輕鏈，以保證輕鏈的正確裝配。在單細胞系表達此類雙功能抗體，分泌的產品正確裝配率高達 92%，能夠滿足規模化生產的要求。但重鏈 CH3 的這一改構方式降低了抗體結構的穩定性，為了克服這一缺點，通過噬菌體展示庫技術篩選不同結構，最終將“臼”型結構改進為更穩定的 3 個氨基酸突變（T366S、L368A、Y407V）形式[4]。在單細胞系中表達“杵臼”結構抗體，要求兩個抗體共用同序列輕鏈，會在一定程度上影響抗體的親和力。為了解決不同輕鏈正確裝配的問題，近年來又開發了雙細胞系分別表達半抗體、體外裝配的新工藝。受到人體 IgG4 抗體在生理條件下自然發生的半抗體隨機交換過程的啟示，GenMab 公司開發了 FAE（Fab-arm exchange）雙功能抗體技術[5]。在兩個目標抗體 IgG1 重鏈 CH3 區分別引入 K409R 和F405L 兩個點突變，就能夠形成類似于IgG4 抗體的半抗體交換重排。將突變后的兩個不同 IgG1 抗體在兩個 CHO細胞系中分別表達并完成半抗體輕重鏈間的裝配，經過蛋白A 親和純化后，利用溫和的氧化劑系統可在體外實現異源半抗體之間的精確裝配。該技術已經實現 1500 L 規模的產業化應用[5]。相似的生產技術也可以應用于“杵臼”結構雙功能抗體的生產。除了共用序列相同的輕鏈或進行體外裝配，通過 Crossmab 技術也可促進抗體輕鏈的正確裝配。代表產品是羅氏公司正在進行 I 期臨床研究的 Ang-2/VEGF CrossMabCH1-CL。Crossmab 技術是在“杵臼”改造的基礎上，將 Ang-2 抗體 Fab 結構域中的 CL 與 CH1 互換，而VEGF 抗體的 Fab 結構則保持不變。經過改造的 Ang-2抗體輕鏈不易與 VEGF 抗體的重鏈發生錯配，同時“杵臼”結構可促進兩條重鏈異源二聚化[6]。除“杵臼”結構之外，還可通過 IgG 和 IgA CH3 的鏈交換（strand-exchange engineered domain，SEED）技術實現不同半抗體的 Fc 配對[7]。

基因工程抗體技術的發展特別是噬菌體展示庫技術的廣泛應用，可對抗體結合表面進行重塑，從而賦予其結合第二抗原的高親和力，通過該技術所構建的雙功能抗體稱為 DAF（dual action fab）。文獻報道，通過對赫賽汀抗體（Herceptin）輕鏈的互補決定區（CDR）的氨基酸序列進行改造，在保持對 HER2 抗原結合能力的條件下，成功獲得了對 VEGF 抗原的親和力；經過進一步親和力成熟后，DAF 抗體對抗原 HER2 和 VEGF 的親和力分別達到 0.2和 3 nmol/L[8]。與其他雙功能抗體利用不同的半抗體可變區結合各自靶抗原不同，DAF 雙功能抗體的雙臂可變區序列相同但又可以同時結合兩個抗原，因而完全保持了正常 IgG抗體的結構，不降低其穩定性，而且可以應用常規抗體表達生產技術實現產業化，其在下游生產工藝、制劑開發和體內藥代動力學等方面具有突出的優勢。

2 雙功能抗體的作用機制

2.1 介導 T 細胞殺傷

雙功能抗體的一個重要機制是介導 T 細胞殺傷。近年來，隨著對癌細胞免疫逃逸機制認識的深入和腫瘤免疫治療（cancer immunotherapy）的興起，激活 T 細胞的抗體藥物研究備受重視。通常認為有效激活 T 細胞需要雙重信號，第一信號來自抗原提呈細胞上 MHC-抗原復合物與 T 細胞受體 TCR-CD3 的結合，第二信號為 T 細胞與抗原提呈細胞表達的共刺激分子相互作用后產生的非抗原特異性共刺激信號。由于多數癌細胞表面的 MHC 的表達下調甚至缺失，從而逃逸免疫殺傷。CD3×雙功能抗體則能夠分別結合 T 細胞表面 CD3 分子和癌細胞表面抗原，從而拉近細胞毒性 T 細胞（cytotoxic T cell，Tc 或 CTL）與癌細胞的距離，引導 T 細胞直接殺傷癌細胞，而不再依賴于 T 細胞的雙重激活信號。CD3×雙功能抗體獨特的 T 細胞激活方式被認為是其作用機制上的重大優勢[2]。

目前與 CD3 抗體偶聯的雙功能抗體靶點有 10 余個，除已經上市的 CD3×EpCAM 雙功能抗體外，CD19、CD20、Her2、CEA 等靶點的雙功能抗體品種也已進入臨床研究。其中最受關注的是美國 Amgen 公司與德國 Micromet公司聯合開發的 BiTE 結構 CD3×CD19 雙功能抗體blinatumomab[9]。該抗體正在進行 III 期臨床研究，用于治療急性前 B 淋巴細胞白血病（B-precursor ALL）。blinatumomab通過介導 T 細胞特異性殺傷 CD19 陽性 B 淋巴癌細胞發揮作用，具有療效好、劑量低的臨床優勢。美羅華抗體治療淋巴癌的臨床用量為 375 mg/(m2?w)，4 周/療程，而blinatumomab 的臨床劑量僅為 5～15 μg/(m2?d)，每個療程連續靜脈注射 28 d。在參加 II 期臨床實驗的 25 名患者中，有 17 名患者（占 68%）在前兩個療程中取得了血液學完全緩解（complete remission，CR）或血液學部分緩解（CR with partial hematological recovery），微小殘留病灶（minimal residual disease，MRD）水平小于 10-4。由于BiTE 結構 CD3×雙功能抗體的獨特結構和作用機制，blinatumomab 在臨床上的不足也很明顯。除前述由于單鏈抗體半衰期短，臨床上需要長期連續靜脈注射之外，CD3 抗體與 T 細胞結合后引起細胞因子風暴，引起臨床較高的副反應發生率。目前介導 T 細胞殺傷的雙功能抗體在血液腫瘤方面顯現出了優勢，但其在實體瘤方面的療效還有待臨床進一步證明。運用 Triomab 技術開發的 CD3×HER2 抗體Ertumaxomab 可應用于治療赫賽汀治療后復發的乳腺癌，但在進入 II 期臨床后即被停止開發。

2.2 雙靶點阻斷

雙功能抗體的另一個重要的作用機制是同時結合雙靶點，阻斷雙信號通路。該機制的應用范圍更為廣泛，包括腫瘤、自身免疫性疾病、抑制血管生長和抗感染等方面的治療。以在細胞生理過程中發揮重要調節作用的跨膜酪氨酸激酶受體 HER 家族為例，該家族包括 HER1（erbB1、EGFR），HER2（erbB2、NEU），HER3（erbB3）及 HER4（erbB4）等成員，在很多上皮來源的實體瘤細胞表面異常高表達，是腫瘤靶向治療的重要靶點。已經上市的抗體有結合 HER2 D4 結構域的赫賽汀單抗、結合 HER2 D2 結構域的帕妥珠單抗（Perjeta）以及結合 HER1/EGFR 的愛必妥單抗（Erbitux）等，廣泛應用于乳腺癌、胃癌、結直腸癌等實體瘤的臨床治療。研究揭示，HER 家族成員自身或不同成員之間的同源或異源二聚體激活細胞內信號，促進細胞增殖、腫瘤發展。赫賽汀抗體阻斷 HER2 受體同源二聚，但不能阻斷 HER2 與其他受體間的異源二聚。HER2 與 HER3是 HER 家族激活初始致癌信號的最強二聚體形式，在臨床上將能夠阻斷該二聚化的帕妥珠單抗與赫賽汀聯用，取得了比單個抗體更好的療效，揭示了雙靶點阻斷的臨床效果[10]。

臨床前研究顯示，能夠結合 HER2 抗原不同結合域的FAE 結構 HER2×HER2 雙功能抗體抑瘤活性優于赫賽汀抗體[11]。能夠同時結合 EGFR 與 HER3 的 DAF 型雙功能抗體，同樣顯示出優于單一靶向 EGFR 抗體 Erbitux 的療效。在自身免疫性疾病治療領域，同時結合 IL-13 和 IL-4雙靶點的“杵臼”結構 IgG4 亞型雙功能抗體也已經進入臨床研究[12]。

3 結語與展望

雙功能抗體的設計依賴于疾病發病分子機制、雙功能抗體作用機制及其副作用機制的深入研究。該領域仍然有很多待解決的問題，如 CD3×雙功能抗體結合 CD3 后如何避免引起細胞因子風暴、雙靶點親和力如何平衡等。

雙功能抗體在雙重阻斷和誘導 T 細胞腫瘤殺傷的作用機制等方面具有無可替代的優勢。隨著上游基因工程技術和下游生產技術的發展，目前可以構建與常規全抗體分子結構一致或相似的雙功能抗體，并實現規模化生產，為雙功能抗體未來更廣泛的應用鋪平了道路；越來越多的雙功能抗體進入臨床研究。可以預見，雙功能抗體藥物在未來將會成為抗體藥物發展的新增長點。

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