用于抗體藥物生產的動物細胞培養基研究進展

段須杰，任彤，羅厚勇，劉睿，徐衛濤

近年來，具有靶向明確，副作用小等優勢的抗體藥物受到國內外藥企的廣泛關注。2012年，抗體藥物全球銷售額已達 650 億美元左右，并占據全球十大暢銷藥物的半壁江山[1]。

動物細胞大規模培養和抗體質量分析已然成為我國抗體藥物產業化的主要限制因素[2]。培養基優化作為動物細胞大規模培養的關鍵環節，長期被國外生物技術公司（如Thermo Fisher 公司、Sigma 公司等）、醫藥巨頭所壟斷。盡管目前國內抗體藥物的表達水平有顯著提高（1～2 g/L），但仍以使用商業培養基為主，缺乏自主知識產權的產品。由于對所使用的培養基成分未知，一旦出現抗體質量問題便無從優化，特別對于生物仿制藥開發而言，抗體質量的一致性顯得尤為重要。與此同時，使用商業化培養基還需承擔較高的開發成本，往往是自主開發培養基成本的 5～10 倍。

1 生產用動物細胞概述

對于抗體藥物而言，為了滿足其生物活性，需要對蛋白質進行正確的折疊和翻譯后修飾，因此用于抗體生產用宿主細胞以哺乳動物細胞為主。迄今為止，在已批準的抗體藥物中，所使用的動物細胞主要包括 CHO 細胞、NS0 細胞和SP2/0 細胞，其中 CHO 細胞作為生產用宿主細胞達到50% 左右，NS0 細胞達到 20% 以上[3]。

CHO 細胞是 1957年 Tjio 和 Puck 將原代培養的中國倉鼠卵巢細胞永生化獲得的，包括 K1、DG44 和DUXB11 三種。其中，DG44 和 DUXB11 細胞由于不具有二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）活性，需要添加甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷才能正常生長。因此兩者通常采用 DHFR 篩選系統獲得生產用細胞株。而 CHOK1 則恰恰相反，常與谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）篩選系統聯用。

NS0 細胞是由 Galfr 和 Milstein 于 1981年獲得的一株不合成分泌免疫球蛋白重鏈或輕鏈的鼠骨髓瘤細胞。與CHO 細胞相比，NS0 細胞更傾向于凋亡，可能是由于營養物耗竭或者培養微環境產生的壓力所造成[4]。此外，NS0 細胞為膽固醇營養缺陷型，因此在培養過程中需要添加膽固醇以維持細胞正常生長。由于 NS0 細胞內源 GS 缺乏活性，因而常與 GS 篩選系統聯用獲得穩定高產的細胞株。

從表達抗體質量的角度來看，CHO 細胞生產的抗體與人類自身抗體更為接近，而采用 NS0 或 SP2/0 細胞所表達的抗體則會產生非人源的糖基化修飾，如 α(1,3)-半乳糖結構和 N-羥乙酰基神經氨酸（N-glycolyl neuraminic acid，NGNA）唾液酸結構，在人體內會產生免疫原性，因而近年來較為少用[3]。值得一提的是，CHO 細胞的內源性反轉錄病毒不易傳播人類，而 NS0 細胞則可能產生傳染性反轉錄病毒[4]。

除此之外，PER.C6 細胞作為一種新型的宿主細胞已用于表達抗體藥物，并能夠獲得與人類更為接近的糖基化結構。但到目前為止，采用 PER.C6 細胞生產的多種候選抗體藥物仍處于臨床研究階段。

2 培養基組分及功能

由于動物細胞對營養物質、培養環境的要求較為苛刻，培養基一般包括 60～80 種營養物質，某些培養基組分甚至超過 100 種。除此以外，不同種類的動物細胞對于培養基組分的要求也不盡相同，而且組分的改變也會對抗體的質量產生顯著影響。因此，如何依據動物細胞種類，通過培養基優化以滿足抗體產量和質量的“雙重要求”成為抗體產業化過程中亟待解決的關鍵環節。

2) 在救助實踐中，救助船舶無害通行權成立和行使的困境、救助船舶進入領海搜尋之禁止、救助船舶越過他國領海所必須履行的通知義務并接受沿海國合法的管理與安排等情形都是這種縱向競合的直接體現。

本文將以介紹 CHO 細胞和 NS0 細胞培養基為主，逐一闡述動物細胞培養基成分及其相應作用，為開發適合動物細胞的“個性化培養基”提供理論指導。

2.1 水

水是培養基的重要組分之一，卻往往被研究人員所忽視，培養基用水品質的好壞將直接影響到細胞的生長狀態。水中的污染物主要包括無機物、有機物、細菌產物（內毒素）、顆粒等。無機物包括重金屬、鐵、鈣、氯等。有機物主要是植物腐敗的副產物和洗滌劑。因此培養基用水必須經過高度純化獲得。一般而言，培養基采用注射用水或者采用同級別的超純水進行配制。

2.2 碳水化合物

葡萄糖是培養基中最常使用的碳水化合物，用于提供能源。然而，葡萄糖代謝會產生對細胞生長和抗體合成重要影響的副產物——乳酸。通過控制葡萄糖濃度或者采用其他能源物質（如半乳糖、果糖等）可以降低培養過程中的乳酸產量，但可能會對抗體的糖基化類型產生影響，進而影響抗體在體內的生物活性[5-7]。此外，也有文獻報道通過在培養基中添加丙酮酸代替谷氨酰胺作為能源物質，可以降低乳酸和氨的產量[8]。

2.3 氨基酸

構成生物體蛋白質的氨基酸約 20 種，大體可分為必需氨基酸（essential amino acid，EAA）和非必需氨基酸（nonessential amino acid，NEAA），它們不僅用于合成蛋白質，同時還通過氨基酸代謝途徑提供能源。由于不同種類的動物細胞甚至同一類別的不同克隆對于氨基酸的代謝情況都可能完全不同，因此，對于培養基中氨基酸的優化顯得尤為重要，不但要保證各種氨基酸濃度的平衡，同時要避免因某種氨基酸消耗殆盡，導致細胞生長停止或者凋亡[9]。

谷氨酰胺作為重要的能源物質，同時還是嘌呤、嘧啶的合成前體，對于非 GS 表達系統的細胞（如 CHO-DHFR 細胞）生長十分重要，主要是由于細胞內源 GS 基因表達水平較低所致。而對于GS 表達系統的細胞（如 GS-CHO 和GS-NS0）而言，谷氨酰胺則無需添加至培養基。除此以外，還應根據具體的細胞株特性來有選擇地添加氨基酸，例如有些 CHO 細胞屬于脯氨酸缺陷型，因此需將脯氨酸作為EAA 添加至培養基中。

2.4 維生素

維生素是維持細胞正常生理狀態的一種重要的生物活性化合物，在細胞中多形成酶的輔基或輔酶。維生素分為水溶性和脂溶性兩類。水溶性維生素主要指 B 族維生素，包括硫胺素（B1）、核黃素（B2）、煙酰胺（B3）、泛酸（鈣）（B5）、吡哆醇（醛）（B6）、生物素（B7）、葉酸（B9）和氰鈷胺素（B12）。脂溶性維生素主要有維生素 A、維生素 D、維生素 E 和維生素 K。與脂溶性維生素相比，水溶性維生素能夠更好維持細胞生長并保證較高的活率[10]。此外，維生素 C 或維生素 E 通常作為抗氧化劑添加至培養基中，但對細胞生長或者抗體合成影響較小[11]。

2.5 無機鹽及微量元素

培養基中的無機鹽包括 Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl–、、、等。其中，Na+、K+和 Cl–負責調節許多營養物質和大分子的跨膜運輸；Mg2+是細胞間質的重要組分，同時還是酶反應的輔因子；Ca2+參與細胞生理活動，并調節細胞膜功能；主要起到 pH 緩沖作用。deZengotita 等[12]研究發現通過流加 NaH2PO4可以顯著提高 GS-NS0 細胞密度，可能是由于磷元素是細胞磷脂、DNA 和 RNA 的重要組成部分。

微量元素主要包含鐵、銅、鋅、硒、錳等。鐵是一種必需元素，因為鐵涉及眾多參與 DNA 復制和細胞代謝的酶，鐵缺陷會引起細胞周期停滯在 G0 或者 G1 期，甚至使快速分裂的細胞發生凋亡[13]。銅離子作為培養基中重要的氧化劑，對抗體質量（二硫鍵形成、C 末端降解、唾液酸含量等）、細胞代謝（細胞密度、乳酸含量等）都會產生重要影響[14-15]。鋅作為胰島素的替代物，在無蛋白培養基開發中得到廣泛應用[16]。硒元素則是谷胱甘肽過氧化物酶的輔因子，能夠保護細胞不受活性氧的傷害[17]。錳元素作為一系列糖基轉移酶重要輔因子，在抗體糖基化過程中起到關鍵作用，改變培養基中 Mn2+濃度可以顯著影響抗體的糖基化特征[18]。

2.6 脂類及前體

脂類是細胞膜的重要組成部分。由于磷脂、脂肪酸和膽固醇共同影響細胞膜的流動性，氯化膽堿、肌醇、乙醇胺、油酸、亞油酸等物質常以脂類前體形式添加至培養基中用于合成細胞膜。與 CHO 細胞不同，NS0 細胞通常為膽固醇缺陷型，因此在 NS0 細胞培養中常將膽固醇以脂類混合物的形式添加，但是脂類的添加有可能會改變蛋白的糖基化特征[19-20]。此外，Li 等[4]通過在培養過程中添加 5-氮雜胞苷使得 NS0 細胞成為膽固醇非依賴性細胞，抗體產量達到4.5 g/L。

2.7 核苷

動物細胞一般可以通過從頭合成途徑合成核苷酸，因此一般情況下不需要在培養基中添加外源核酸類物質。但對于從頭合成途徑受阻的細胞（DHFR 缺陷型細胞）就必須添加補救途徑的底物——次黃嘌呤和胸苷。Chen 等[21]研究發現每 5 mg/L 胸苷中添加 10 mg/L 次黃嘌呤能夠顯著促進CHO 細胞生長。Carvalhal 等[22]在培養基中添加 1 mmol/L腺嘌呤或鳥嘌呤會造成 CHO 細胞生長嚴重抑制，而相同濃度的尿嘧啶或胞嘧啶則對細胞生長沒有影響。此外，核苷類物質的添加還可能對抗體的糖基化特征產生影響，因此在培養基優化時需特別注意[23]。

2.8 生長因子及轉運蛋白

胰島素和胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）常添加至培養基中，兩者均能夠刺激葡萄糖利用，以及 RNA、蛋白質和磷脂的合成。Rouiller 等[24]通過添加糖皮質激素（氫化可的松）可以顯著提高 CHO 細胞活率并提高蛋白產量，而 Jing 等[25]通過添加地塞米松在提高糖蛋白的唾液酸含量方面取得了成功。

轉鐵蛋白是一種常用的糖蛋白，能夠結合鐵，與鐵向細胞的傳遞密切相關。由于轉鐵蛋白成本較高，人們逐漸采用鐵螯合劑來代替轉鐵蛋白。Zhang 等[26]發現檸檬酸鐵和亞硒酸鈉的復合物能夠有效地代替轉鐵蛋白。陳飛[27]認為在無血清培養基中沒有檸檬酸鐵存在時，即使添加高濃度的轉鐵蛋白也不能有效支持 CHO 細胞生長和抗體表達，也就是說檸檬酸鐵在支持 CHO 細胞生長方面具有轉鐵蛋白不可替代的作用。

2.9 其他物質

2.9.1 還原劑 還原型谷胱甘肽和巰基乙醇通常作為還原劑添加至培養基中，可以保護細胞免受活性氧損傷，對維持細胞活率起到一定作用。

2.9.2 保護劑 Pluronic F68、甲基纖維素和聚乙烯醇常作為保護劑加入培養基中，可減少細胞與氣泡間的黏附力，避免由于氣泡破裂對細胞造成的損傷[28]。

2.9.3 誘導劑 丁酸鈉作為一種誘導劑，常添加至培養基中用于提高抗體產量[29]，但是丁酸鈉的加入可能對抗體的糖基化形式也會有影響。Borys 等[30]通過添加丁酸鈉顯著降低了 NGNA 的含量。

3 培養基開發策略及手段

3.1 培養基開發策略

盡管 CHO 細胞和 NS0 細胞對于培養基組分的要求有所不同，但是都需要添加數十種組分來維持細胞的正常生長和抗體表達。與此同時，進行培養基優化時不僅需要考慮單一組分的影響，還要關注組分間還可能存在的交互作用，這就使得培養優化成為耗時且復雜的工作。因此，選擇合適的培養基開發策略及手段將直接決定培養基的開發時間和最終效果。對于動物細胞的培養基開發策略大體相同，主要分為基礎培養基開發和流加培養基開發兩個階段。

3.1.1 基礎培養基開發策略 基礎培養基是以支持并促進細胞生長為目的，其開發策略可以分兩類：自下而上（Bottom-Up）和自上而下（Top-Down）[31]。Bottom-Up 策略是指分別考察單一組分不同濃度對細胞生長和產物合成的影響。該策略由于需要逐一考察每個組分的影響，因此需要大量試驗且非常耗時。而 Top-Down 策略則是將培養基首先分成若干“亞類”（subgroup），針對“亞類”進行篩選和組合，而后針對“亞類”內組分進行優化。Ma 等[32]通過Top-Down 策略成功開發了適合 CHO 細胞和 NS0 細胞的化學成分明確的培養基。需要指出的是，無論通過何種策略開發出的基礎培養基，往往需要與流加培養基聯合使用，以判斷該基礎培養基的各類組分是否滿足流加培養模式。

3.1.2 流加培養基開發策略 與基礎培養基不同，補料培養基的添加是為了增加細胞密度，延長細胞活率，并提高抗體產量，通常包括葡萄糖、氨基酸、維生素和磷酸鹽，而無機鹽和微量元素往往不包含在內。因此，設計流加培養基一方面要保證營養成分不會耗竭，同時也不能造成乳酸、氨等代謝副產物過度累積。Xie 和 Wang[33]根據雜交瘤細胞組成，葡萄糖、氨基酸和維生素的消耗速率設計流加培養基和流加策略，可以顯著地降低乳酸和氨的含量。

3.2 培養基開發手段

3.2.1 試驗設計 試驗設計（DOE）是一種安排試驗和分析試驗數據的數理統計方法，以較少的次數、較短的周期和較低的成本，獲得理想的試驗結果以及得出科學結論。培養基開發過程中常用的試驗方法主要有一次一因素（OFAT）設計、Plackett-Burman 設計、混料設計、響應面設計等[34-37]。

OFAT 設計指通過改變單一因素的濃度來確定其最優濃度。但由于動物細胞培養基成分復雜，且存在因素間的交互影響，因此該方法只適用于個別組分的優化。Plackett-Burman 設計是一種兩水平的試驗設計方法，可以通過最少的試驗次數從大量考察因素中迅速篩選出顯著影響因素，但該方法卻忽略了因素間的交互作用[34]。響應面設計則是通過對有限的因子進行建模和函數擬合，考慮因子間的交互關系，已達到最優響應效果的一種方法[35]。混料試驗常用于基礎培養基和植物水解物的優化，DMEM/F12培養基便是混料試驗的最佳例證[37]。上述 DOE 設計方法均可借助商業化軟件完成試驗設計，例如 Design Xpert、Minitab 等。

3.2.2 培養基消耗分析 通過檢測不同時期細胞培養上清營養物（如氨基酸、維生素、微量元素等）及代謝物（如乳酸、氨、CO2等）濃度，計算其消耗或生成速率，并在此基礎上設計流加培養基組分，既要避免營養物在培養過程中消耗殆盡，又要防止營養物流加過剩，造成代謝副產物累積。目前，市售的商業化儀器已經基本滿足上述物質的測定，如生化分析儀（NOVA）、高效液相色譜（HPLC）、電感耦合等離子發射光譜（ICP）等。

3.2.3 代謝組學 代謝組學（Metabolomics）是通過對比不同試驗組的所有代謝物組分，尋找其他代謝譜差異的研究方法。通過代謝組學可以提供培養基優化過程中組分改變對于細胞代謝中間產物乃至整個代謝網絡的影響，從而為培養基優化工作提供更堅實的理論基礎[38-39]。Dietmair 等[39]通過代謝組學研究不同培養基對 CHO 細胞生長（比生長速率和最高細胞密度）的影響，并確定了一系列與細胞生長有關的代謝中間產物。

3.2.4 高通量篩選系統 由于涉及數十種組分的篩選和優化，如采用傳統的孔板或搖瓶方式進行培養基開發工作，一方面耗時費力，另一方面試驗培養條件的精確控制較難，進而影響對試驗結果的判斷。而高通量篩選系統（SimCellTM、Micro-24TM、ambrTM等）的出現不僅能夠模擬反應器的控制條件，而且能夠實現試驗條件的高通量篩選，顯著加快培養基開發進程[40]。例如，SimCell 是一種由 Bioprocess 公司開發的用于流加培養的微型生物反應器，能夠實時監測細胞密度、活率、pH 和溶氧，每個微反應體積為 650 μl，可同時進行上千個試驗[41]。

4 結語與展望

近年來，抗體藥物在國內外發展勢頭迅猛。一方面國家通過新藥創制科技重大專項為生物醫藥產業發展提供強有力的科技支撐，另一方面越來越多的抗體藥物面臨“專利懸崖”，使得國內大量資金流向生物仿制藥的研發。

然而，國內大多數企業尚不具備抗體藥物開發的關鍵技術。特別對于培養基而言，90% 以上的企業仍以使用商業培養基為主，使得開發成本居高不下。一旦出現產品質量問題，便很難對培養基進行優化。如何根據細胞株特性設計“個性化培養基”以滿足抗體藥物產量和質量的“雙重要求”已成為國內從事抗體藥物開發企業需要亟待解決的問題。作者期望通過對近年來動物細胞培養基開發研究進行綜述，對國內研發人員從事培養基優化起到一定的指導作用，從而提高國內生物制藥企業的核心競爭力，早日實現中國抗體產業的繁榮。

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