土霉素及鎘污染對土壤呼吸及酶活性的影響

閆 雷，畢世欣，趙啟慧，王 喆，潘東琪，曲娟娟

（東北農業(yè)大學 資源與環(huán)境學院 寒地黑土資源利用與保護重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150030）

抗生素（antibiotics）是20世紀最偉大的發(fā)明之一，其發(fā)明后被用于預防和治療人類及動物的疾病，同時作為促生長劑長期添加于動物飼料中加快畜禽及水產(chǎn)品的生長。土霉素（OTC）是四環(huán)素類抗生素之一，具有質優(yōu)價廉、廣譜抗菌性的特點，在畜禽生產(chǎn)中應用廣泛。進入動物機體內的大部分土霉素不能完全被吸收，高達75%以上以原形或代謝物形式經(jīng)由畜禽糞尿排入環(huán)境，經(jīng)不同途徑（堆肥）對土壤和水體造成污染［1－4］。Hamscher等 人［5］研 究 了 獸 用 抗 生素在土壤中的殘留，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素在土壤10—20cm處可達200μg／kg。德國施用動物糞肥后的土壤中土霉素的殘留最大濃度為32.3mg／kg［6］。在我國，大型養(yǎng)殖場周圍土壤中土霉素含量高達200mg／kg［7］，在水產(chǎn)養(yǎng)殖廠的沉積物中更是高達285mg／kg［8］。重金屬污染已成為人們日益關注的問題，中國環(huán)境保護部和國土資源部于2014年4月17日發(fā)布的“全國土壤污染狀況調查公報”中指出，全國土壤重金屬污染總的點位超標率為16.1%。與其他重金屬相比，鎘（Cd）在土水系統(tǒng)中有較高的遷移能力，更易對環(huán)境產(chǎn)生毒害［9］。調查發(fā)現(xiàn)我國珠三角地區(qū)土壤中Cd含量在0.57～11.0mg／kg［10］，湖南寶山礦區(qū)局部表層土壤Cd含量高達2 587mg／kg［11］。江蘇省某市疾病預防控制中心在對該市從事飼料生產(chǎn)的企業(yè)調查時發(fā)現(xiàn)，某些豬飼料中鎘的含量高達370mg／kg［12］。這主要是由于鋅礦中常含有鎘，當鋅礦作為礦物質原料被添加到飼料中時可能會造成鎘的污染；另外，使用鍍鎘機具加工飼料，也可能是造成鎘污染的原因之一［13－14］。攝入過量的鎘對生物體的危害極其嚴重，會導致腎臟、肝臟、肺部、骨骼、生殖器官的損傷，對免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等具有毒性效應，進而引發(fā)多種疾病。

抗生素與重金屬復合污染物通常通過畜禽糞便進入土壤生態(tài)系統(tǒng)中，其復合污染對環(huán)境的影響日益突出，成為熱點關注問題，目前國內外研究者［15－20］針對抗生素和重金屬污染已有大量研究。張樹清等［15］對我國7省、市、自治區(qū)的典型規(guī)模化養(yǎng)殖場畜禽糞便的主要成分分析發(fā)現(xiàn)，豬糞中土霉素平均含量為9.09mg／kg，最高達134.75mg／kg，重金屬鎘的平均含量為13.25mg／kg，最高達120.13mg／kg。De等［16］研究發(fā)現(xiàn)南極地區(qū)的水域中存在具有重金屬和抗生素抗性的菌落。吳丹等人［17］研究發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶和蔗糖酶活性在Cd濃度為10mg／kg的時候達到最高值。劉琳等［19］研究表明OTC對土壤中蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性毒性強度隨著投加濃度升高而增加。Kong等人［20］研究OTC與Cu復合污染對水稻土土壤微生物群落功能時發(fā)現(xiàn)，OTC和Cu對土壤微生物群落功能多樣性、均一度和平均顏色變化率（AWCD）的負面影響有明顯的加合作用。但有關抗生素和重金屬復合污染對東北地區(qū)典型耕作土壤—黑土土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響研究還鮮見報道。本研究以土霉素和重金屬鎘作為目標污染物，采用室內培養(yǎng)法，通過探討微生物呼吸和土壤酶活性的變化規(guī)律，以期進一步完善抗生素與重金屬的生態(tài)毒理效應研究，為其環(huán)境風險評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自東北農業(yè)大學試驗田（土霉素和重金屬鎘未見檢出）。除去地面植被、枯枝落葉及表面1cm左右的表土，采樣深度為2～20cm，過20目篩，風干后裝袋備用。其理化性質詳見表1。土霉素原藥（純度≥88.8%），購自黑龍江省藥檢所，其他試劑均為分析純。

表1 供試土壤理化性質

1.2 試驗設計

1.2.1 土壤呼吸強度測定 取部分冷藏于冰箱中的風干土樣，在25℃的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)7d，以恢復微生物活性。稱取若干份土壤，每份50g置于100ml的高型燒杯中，加入1.0g葡萄糖，混勻，加入不同質量分數(shù)的土霉素溶液或硫酸鎘溶液。試驗分為兩個處理組，第一組：單一處理組，使土霉素在土壤中的濃度分別為0，1，50和200mg／kg，重金屬鎘在土壤中的濃度為10mg／kg；第二組：復合處理組，使土霉素和重金屬鎘在土壤中的濃度分別為：〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕。各處理均設3個重復，并調節(jié)土壤含水量達田間最大持水量的60%，置于密閉容器中。同時將盛放有35ml 0.1mol／L NaOH的100ml的高型燒杯放入密閉容器底部，蓋嚴瓶蓋，分別于培養(yǎng)后的1，7，15，21，27d測定其呼吸強度。土壤呼吸強度采用直接吸收法滴定測定［21］。

1.2.2 土壤酶活性測定 取部分冷藏于冰箱中的風干土樣，在25℃的培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)7d，以恢復微生物活性。稱取若干份土壤，每份100g置于三角瓶中，加入不同質量分數(shù)的土霉素溶液或硫酸鎘溶液。試驗分為兩個處理組，第一組：單一處理組，使土霉素在土壤中的濃度分別為0，1，50和200mg／kg，重金屬鎘在土壤中的濃度為10mg／kg；第二組：復合處理組，使土霉素和重金屬鎘在土壤中的濃度分別為：〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕，〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕。各處理均設3個重復，定期加水以保持土壤含水量為田間最大持水量的60%。分別于第1，7，15，21，27天取樣測定蔗糖酶、脲酶和磷酸酶的酶活性。土壤酶活性測定參見關松蔭等方法［22］，土壤蔗糖酶采用3，5—二硝基水楊酸比色法；土壤脲酶采用苯酚鈉—次氯酸鈉比色法；土壤磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

土壤呼吸和土壤酶活性的影響率計算公式為：

式中：A——添加污染物土壤呼吸或土壤酶活性；B——不添加污染物土壤呼吸或土壤酶活性，正值表示激活，負值表示抑制。復合污染的交互作用類型的判斷參考沈國清與Gao等方法［23－24］，當復合處理的實測值＞理論值時，表示協(xié)同作用；當實測值＜理論值時，表示拮抗作用。其中，理論值為各處理濃度下平均影響率的加和；實測值為試驗實際測定影響率。試驗數(shù)據(jù)采用Excel處理，統(tǒng)計分析采用SPSS軟件。

2 結果與分析

2.1 土霉素與鎘對土壤微生物呼吸的影響

在室內模擬條件下，鎘單一污染對土壤微生物呼吸的影響結果如圖1所示。從圖1可以看出，10mg／kg Cd處理下，培養(yǎng)第1天即對土壤微生物呼吸產(chǎn)生了強烈的抑制作用，抑制率高達78.05%。這可能是由于在培養(yǎng)初期重金屬產(chǎn)生的毒性抑制甚至殺死了部分敏感的土壤微生物，導致土壤微生物呼吸下降［25］。當培養(yǎng)第7天時，發(fā)現(xiàn)Cd對土壤微生物呼吸的影響轉為激活作用，但激活率不高，只有6.66%。隨著培養(yǎng)時間的延長，激活作用逐漸增強，第21天達最大激活率38.75%；而后激活率逐漸降低，直至培養(yǎng)結束恢復到對照水平（p＞0.05）。分析其原因可能是在重金屬的脅迫下，微生物代謝過程的能源利用效率降低，需要更多的碳進行維護并最終增加呼吸；另一方面殺死微生物時發(fā)生的分解反應也會增加基底呼吸，進而達到激活的效果［26］。而到培養(yǎng)后期，土壤微生物逐步適應了這種環(huán)境，恢復到對照水平。

圖1 鎘單一污染對土壤微生物呼吸的影響

土霉素單一污染對土壤微生物呼吸的影響結果如圖2所示。從圖2可以看出，在整個培養(yǎng)過程中（1～27d），1mg／kg OTC濃度處理對土壤微生物呼吸具有明顯的激活作用（p＜0.05），50和200mg／kg OTC對土壤微生物呼吸的影響表現(xiàn)為先抑制后激活，且OTC濃度越高，對微生物呼吸抑制作用時間越長。已有的研究報道發(fā)現(xiàn)，雖然OTC可抑制土壤中細菌和放線菌的生長，但可以促進真菌的生長［27－28］。本試驗中1mg／kg OTC對土壤微生物的呼吸激活效應可能是由于土壤中細菌和放線菌活性受到抑制，真菌等其他微生物獲得大量營養(yǎng)物質，從而活性增強；另外，抗生素本身作為碳源被微生物分解利用，或其通過物理或化學作用的降解釋放出二氧化碳，增加了呼吸量［29］。而當OTC污染濃度不斷增大，施藥后土壤中抗生素含量超過了影響土壤微生物呼吸作用的濃度閾值，甚至殺死了某些微生物，因此表現(xiàn)為抑制［30］。但這種抑制作用是非持續(xù)性的，當抗生素的含量低于藥物對土壤微生物呼吸影響的濃度閾值時，呼吸作用逐漸開始恢復。另一方面隨著土壤微生物耐受性增加，土壤中產(chǎn)生抗性種群，以該種抗生素為碳源，促使土壤微生物的呼吸由抑制逐漸恢復正常直至轉為激活［31］。

圖2 土霉素單一污染對土壤微生物呼吸的影響

土霉素與鎘復合污染對土壤微生物呼吸的影響結果如圖3所示。從圖3可以看出，與單一污染處理相比，在1mg／kg OTC與10mg／kg Cd復合處理下對土壤微生物呼吸的影響呈現(xiàn)出“抑制—激活—抑制”的規(guī)律。且在7～21d復合處理的影響與兩者單一處理時趨勢一致，均為顯著的激活作用（p＜0.05），在此階段OTC，Cd兩者單一處理的平均激活率分別為46.04%和20.87%，復合處理平均激活率為132.86%，為兩者單一處理之和的2倍左右，Cd增強了對土壤微生物呼吸的激活作用。表2為OTC與Cd對土壤微生物呼吸和土壤酶活性的平均影響率及其交互作用類型。從表2中可以看出，復合處理〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕對土壤微生物呼吸影響的實測值＞理論值，總體來看，交互作用類型為協(xié)同激活。當OTC的處理濃度逐漸增大，達到〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕時，培養(yǎng)第1天為激活作用，這與兩者單一污染時的抑制作用相反，表明復合污染使土壤CO2的釋放量增加了，土壤微生物呼吸由原來的受抑制轉為被激活。從培養(yǎng)第7天開始，復合污染對微生物呼吸的影響與OTC單一作用時趨勢一致，第15天時出現(xiàn)了最高激活率300.82%，總體來說復合處理表現(xiàn)出協(xié)同激活作用。當OTC的污染濃度進一步增大至〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕時，復合處理對土壤微生物呼吸作用的影響與OTC單一污染時完全一致，均為先抑制后激活，交互作用類型為拮抗激活。

圖3 土霉素與鎘復合污染對土壤微生物呼吸的影響

表2 土霉素與鎘對土壤微生物呼吸和土壤酶活性的交互影響率

2.2 土霉素與鎘對蔗糖酶活性的影響

蔗糖酶又稱轉化酶，廣泛存在于土壤中，對于增加土壤中易溶解的營養(yǎng)物質起重要作用。一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶的活性越強［32］。鎘單一污染對蔗糖酶活性的影響如圖4所示。從圖4可以看出，在整個培養(yǎng)過程中（1～27d）重金屬鎘對蔗糖酶的影響為顯著抑制作用（p＜0.05），抑制率隨時間延長先增大后減小，最大抑制率為20.92%（第7天）。郝英華等人［33］的研究也發(fā)現(xiàn)，Cd可以抑制土壤蔗糖酶的活性。抑制作用可能是由于添加重金屬后抑制了土壤微生物的生長和繁殖，減少了體內酶的合成量和分泌量，削弱了土壤中C，N營養(yǎng)元素的循環(huán)速率和能量流動，最終導致土壤酶活性下降［34］。

圖4 鎘單一污染對土壤蔗糖酶活性的影響

土霉素單一污染對蔗糖酶活性的影響如圖5所示。從圖5可以看出，土霉素單一污染下，培養(yǎng)第1和第7天，所有處理濃度的OTC均對蔗糖酶表現(xiàn)為顯著抑制（p＜0.05），抑制率隨濃度的升高而增大，最大抑制率為77.24%（200mg／kg，第7天）。培養(yǎng)第15和第21天，除1mg／kg處理轉為激活作用外，其余各處理仍為顯著抑制（p＜0.05）。培養(yǎng)第27天，200mg／kg處理也轉為激活作用，只有50mg／kg處理仍為抑制作用。總體來說，在整個培養(yǎng)過程中（1～27d），1mg／kg OTC對蔗糖酶活性的影響呈現(xiàn)先抑制后激活的規(guī)律，其余各濃度處理主要表現(xiàn)為抑制作用。這也進一步驗證了Gao等人［24］的試驗，他們在研究100mg／kg OTC對蔗糖酶活性的影響時發(fā)現(xiàn)，OTC對蔗糖酶的影響均為顯著的抑制作用（p＜0.05）。由于土壤與OTC電荷形式差異，及OTC含有較多極性／離子型官能團可引發(fā)陽離子交換、金屬離子架橋和氫鍵作用等原因，在酸性和中性條件下土壤易于對OTC進行吸附，并且在酸性環(huán)境中OTC較為穩(wěn)定，半衰期較長［35］。本試驗中土壤的pH值為6.5，因此較高濃度OTC脅迫對系統(tǒng)內微生物存在長期毒性作用，從而造成土壤酶活性顯著降低。

圖5 土霉素單一污染對土壤蔗糖酶活性的影響

土霉素與鎘復合污染對蔗糖酶的影響結果如圖6所示。由圖6可知，復合污染下蔗糖酶活性顯著降低（p＜0.05），且復合處理中OTC濃度越大，蔗糖酶活性越小，說明復合污染對蔗糖酶活性存在顯著的抑制作用。同時可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，各處理濃度下的復合污染對蔗糖酶活性的抑制作用基本上逐漸減弱。與OTC和Cd單獨處理時相比，除〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕外，其余各復合處理對蔗糖酶的影響情況與單一污染時相同，復合污染交互作用類型均為拮抗抑制。該結果與已有的相關文獻報道較為相似，如沈國清等人［23］研究發(fā)現(xiàn)，菲和鎘復合污染在整個培養(yǎng)期間（1～49d）始終抑制了蔗糖酶的活性，平均抑制率達53.57%，復合污染表現(xiàn)為協(xié)同抑制作用。

圖6 土霉素與鎘復合污染對土壤蔗糖酶活性的影響

2.3 土霉素與鎘對脲酶活性的影響

脲酶是一種酞胺水解酶，在土壤中主要來自于植物和微生物，其在氮肥利用和土壤氮素代謝方面有重要意義［32］。鎘單一污染對脲酶活性的影響結果如圖7所示。由圖7可見，重金屬Cd對脲酶具有顯著抑制作用（p＜0.05），這與程金金和張平等人［36－37］的研究結果一致。其抑制機理可能與酶分子中的活性部位巰基和含咪唑的配體等結合，形成較穩(wěn)定的絡合物，產(chǎn)生了與底物的競爭性抑制作用有關［38］。

圖7 鎘單一污染對土壤脲酶活性的影響

土霉素單一污染對脲酶活性的影響結果如圖8所示。由圖8可知，1mg／kg OTC在整個培養(yǎng)期對脲酶活性具有抑制作用。在培養(yǎng)第1天和第27天的抑制率不超過1%，與對照相比無顯著差異（p＞0.05），培養(yǎng)中期（7～21d）抑制率為3.89%～13.45%。當OTC處理濃度增至50mg／kg時，對脲酶活性的影響呈現(xiàn)出“激活—抑制—激活”規(guī)律，試驗結果與文獻報道不十分一致，Yang等人［39］研究認為50mg／kg OTC對小麥根際土壤脲酶活性無明顯的影響。這可能是因為根際土壤微生物活性較高，對外來物質的脅迫具有更強的抗性。本試驗中出現(xiàn)激活作用可能是由于OTC具有酰胺鍵結構，而脲酶以酰胺鍵作為底物，根據(jù)底物誘導原理，導致OTC對脲酶活性的正效應大于負效應，即為激活［40］。當OTC單獨處理濃度達到200mg／kg，其對脲酶活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用（p＜0.05）。劉惠君等［41］在研究酰胺類除草劑與脲酶的相互作用機制時發(fā)現(xiàn)，除草劑與脲酶之間有結合作用，二者之間可形成結合位點，并且溶解度越大，結合作用越強。高濃度OTC（200mg／kg）與脲酶分子之間可能也存在著這種作用機制，形成結合位點而發(fā)生作用，從而抑制了脲酶活性。

圖8 土霉素單一污染對土壤脲酶活性的影響

土霉素與鎘復合處理對土壤脲酶的影響結果如圖9所示。從圖9可以看出，〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕復合處理條件下，培養(yǎng)第1天顯著抑制了脲酶活性，抑制率高達26.05%，與兩者單一污染時相比，脲酶活性明顯降低，這表明在培養(yǎng)第1天復合處理在一定程度上增強了對脲酶的抑制作用。從培養(yǎng)第7天開始，〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕復合處理對脲酶轉為激活作用，但激活率不高，始終沒有超過5%，總體來看復合處理仍為拮抗抑制。當復合處理濃度為〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕和〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕時，對脲酶的影響均為抑制作用，抑制率隨時間的延長呈現(xiàn)“下降—上升—下降”的規(guī)律，最大抑制率為65.14%〔第15d，（200＋10）mg／kg〕。統(tǒng)計分析結果發(fā)現(xiàn)，在整個培養(yǎng)過程中（1～27d），除第7天處理濃度為〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕和〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕外，其余各濃度處理下，兩者單獨污染與復合污染對脲酶相比都有顯著差異（p＜0.05）。

圖9 土霉素與鎘復合污染對土壤脲酶活性的影響

2.4 土霉素與鎘對磷酸酶活性的影響

磷酸酶是一類催化土壤有機磷化合物礦化的酶，其活性高低直接影響著土壤中有機磷的分解、轉化及其生物有效性［32］。鎘對磷酸酶活性的影響結果如圖10所示。從圖10可以看出，重金屬鎘單獨處理對磷酸酶活性具有抑制作用，最大抑制率為30.04%，但抑制率隨培養(yǎng)時間的變化呈現(xiàn)一定波動性，表現(xiàn)為“增大—減小—增大”的現(xiàn)象。這與陸文龍［42］的研究結果一致，該研究在分析10mg／kg Cd污染對土壤磷酸酶活性的影響時也發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，其抑制率也表現(xiàn)出“增大—減小—增大”的波動性。同樣，Khan和 Moreno［43－44］的研究也表明 Cd能抑制土壤磷酸酶的活性。

圖10 鎘單一污染對土壤磷酸酶活性的影響

土霉素單一污染對磷酸酶活性的影響結果如圖11所示。從圖11可以看出，培養(yǎng)第1天，1mg／kg OTC濃度處理對磷酸酶活性的影響為抑制，但抑制率很低，僅為4.48%，與對照相比無顯著差異（p＞0.05）；50和200mg／kg處理表現(xiàn)為顯著激活（p＜0.05），最大激活率為88.56%（50mg／kg OTC）。培養(yǎng)第7天，除200mg／kg處理仍為顯著的激活作用（p＜0.05），OTC其余濃度處理對磷酸酶均轉為顯著性抑制（p＜0.05），抑制率在7.33%～26.01%。隨著時間的推移，至第27天，OTC各濃度處理對磷酸酶的抑制或激活已降至較低水平，說明此時磷酸酶受OTC的影響已基本恢復。本試驗中，200mg／kg OTC在整個培養(yǎng)期內，對磷酸酶活性的影響以激活作用為主，這也進一步證實了Gao等人［24］的研究，較高濃度處理OTC對堿性磷酸酶的活性具有激活作用。

土霉素與鎘復合處理對磷酸酶的影響結果如圖12所示。從圖12可以看出，復合處理為〔（OTC＋Cd）＝（1＋10）mg／kg〕時，在整個培養(yǎng)過程中（1～27 d），對磷酸酶的影響呈現(xiàn)出“抑制—激活—抑制”的規(guī)律，復合處理表現(xiàn)為拮抗抑制作用。統(tǒng)計分析結果表明，除第1天外，其余培養(yǎng)時間內土霉素—鎘復合處理對磷酸酶的影響與OTC單獨處理具有顯著差異（p＜0.05）。土霉素—鎘復合污染為〔（OTC＋Cd）＝（50＋10）mg／kg〕時，對磷酸酶的影響呈現(xiàn)“激活—抑制—激活—抑制”的規(guī)律，主要表現(xiàn)為拮抗激活作用。〔（OTC＋Cd）＝（200＋10）mg／kg〕在整個培養(yǎng)過程中呈現(xiàn)先激活后抑制的規(guī)律，最大激活率為18.89%，復合處理表現(xiàn)為協(xié)同激活作用。總體來說，復合污染的作用效果與OTC單一污染時基本相同，均呈現(xiàn)一定的波動性，其作用機理有待進一步研究。

圖11 土霉素單一污染對土壤磷酸酶活性的影響

圖12 土霉素與鎘復合污染對土壤磷酸酶活性的影響

3 結論

（1）重金屬鎘單獨污染時，對土壤微生物呼吸表現(xiàn)出先抑制后激活作用；對土壤酶活性具有顯著抑制作用，平均抑制率從大到小依次為：蔗糖酶＞磷酸酶＞脲酶。

（2）土霉素單獨污染時，1mg／kg土霉素可顯著激活土壤微生物呼吸，而50或200mg／kg土霉素對土壤微生物呼吸表現(xiàn)為先抑制后激活；各處理濃度下的土霉素對蔗糖酶和脲酶活性具有抑制作用，對磷酸酶活性的影響呈現(xiàn)出一定的波動性。

（3）土霉素與鎘復合污染對土壤微生物呼吸和土壤酶活性的交互作用的影響較為復雜，交互作用類型與土霉素濃度有一定的關聯(lián)性，主要表現(xiàn)為，當土霉素的濃度為1和200mg／kg時，復合污染主要為拮抗作用，但當土霉素的濃度為50mg／kg時，復合污染主要為協(xié)同作用。

（4）與土壤酶活性相比，土壤微生物呼吸對土霉素與鎘脅迫條件下的反應更為敏感。

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