微生物蛋白質組學研究現狀

金玉蘭，邢 剛，阮系真

(浙江大學農業部動物病毒學重點實驗室，浙江杭州310058)

隨著人類基因組的繪制成功，標志著后基因組時代的到來。由于基因的功能主要是通過其表達的蛋白質來實現，要了解該基因的全部信息，必須對其編碼的蛋白質進行深入研究。蛋白質組學分析為研究微生物的生命活動和細胞功能提供了廣闊的視野。因此，蛋白質組學在生命科學研究中具有十分重要的位置，隨著研究的不斷深入，蛋白質組學必將對人類的生活和生產帶來十分重大的影響。本文主要就目前微生物蛋白質組學的研究現狀進行簡要闡述。

蛋白質組學是指研究一個細胞、一個組織或一種生物在給定的時期、特殊條件下表達的所有蛋白質的總和。蛋白質組學研究通過對生物體內表達的各種蛋白質進行識別和定量分析，確定其在細胞內外的定位、修飾、相互作用和功能，以期獲得對生命本質和活動規律的全景式認識。相對于其他生物，微生物結構簡單、易于培養和處理。同時，許多動物在代謝過程中所需基因在微生物體系中也是保守的，所以微生物是研究蛋白質網絡體系的理想模式生物。為此，微生物蛋白質組學已被用于解決某些復雜的生物學問題，有眾多的微生物蛋白質組學研究結果發表。本文中，我們選擇了目前微生物蛋白質組學研究的一些亮點進行綜述，以期為同行研究提供參考。

1 基于質譜鑒定技術改進的基因組注釋

越來越多的微生物基因組被測序，且新一代的測序系統速度仍在加快，在對這些基因組序列進行注釋的過程中遇到的最大挑戰就是準確預測蛋白質的編碼區。

為解決該問題，Jaffe 等(2000)［1］建議使用蛋白質組學信息對基因組注釋進行系統的驗證和改進。該實驗小組通過對肺炎支原體M129 株689 個預測的蛋白質編碼區進行驗證，最后通過MS/MS 方法共驗證了557 個蛋白質編碼區。

另外，Jaffe 等(2000)［1］應用蛋白質組學數據鑒定了16 個新的蛋白質編碼區，糾正了19 個ORFs的N 端翻譯起始點，修改了9 個不編碼蛋白的ORFs。這種方法其實也叫蛋白質基因組學，并被廣泛用于改進某些細菌的基因組注釋，例如異常球菌屬，若干分支桿菌，耶爾森菌屬KIM 及兩個細菌菌落基因組等［2－3］。

總的來說，上述研究表明，通過蛋白質組學試驗對基因組注釋進行驗證和校正是一種十分有用的方法。

2 定性和定量蛋白質組學研究

定性蛋白質組學研究揭示了某些特殊原核生物，尚不為人知的驚奇生理活動。

例如，有研究者鑒定了硫礦硫化葉鈞P2 株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，過去人們普遍認為這類古生菌沒有糖原異生過程［4］，還有研究者鑒定了厭氧粘細菌2CP 過去認為不存在的發酵通路。有人對既定生長條件下的表達蛋白質進行研究，鑒定了某些與特定生理過程相關的蛋白質和通路。也有人利用蛋白質組學方法對白喉棒狀桿菌和結核分支桿菌等致病菌的表面蛋白特點進行分析，鑒定了新的參與宿主細胞粘附和侵襲的新蛋白［5－6］。

Ziebandt 等(2010)［7］采用同樣方法分析了25株臨床金黃色葡萄球菌菌株的分泌蛋白質，發現只有一個確定蛋白之間的有限重疊，表達蛋白質之間的高度異質性可能會阻礙疫苗的開發。Otto 等(2010)［8］對枯草芽胞桿菌在葡萄糖饑餓條件下的蛋白質組學變化進行了檢測。作者利用N 同位素標記監測了枯草芽胞桿菌在對數期過渡到穩定期5個不同時間點的蛋白質組學變化。證實許多代謝途徑，如糖降解和氨基酸合成被關閉，生長停滯，而糖異生和三羧酸循環被誘導。

目前，半定量方法已被成功應用于改善生物技術。例如，對乳酸乳球菌的蛋白質組學分析，已被用于確定人類纖維化跨膜電導調節器CFTR 異源表達潛在的瓶頸。應用差別標記和LC-MALDI-TOF MS/MS 對野生型和表達CFTR 的L.lactis 細胞進行總蛋白表達模式分析，結果發現在表達CFTR 的乳酸乳球菌中，有一些與蛋白質錯誤折疊相關的蛋白質被誘導。因此，作者就CFTR 的表達量整體降低提出了兩個假說。一是CFTR 的正確折疊被細胞認為是錯誤折疊，從而引發應激。二是該蛋白要正確折疊則需其它伴侶分子的協助。在另一項研究中，蛋白組學信息被用來改善大腸桿菌中異質N-糖基化的活性。試驗結果表明，提高乙醛酸循環的活性可以增加Arc A 糖蛋白的糖基化率，該推測已被其它試驗所證實［9］。

除了研究細胞內的蛋白質組成，蛋白質組學方法也被用來分析蛋白質的翻譯后修飾。磷酸化在真核細胞的調控中起著關鍵作用，但對于其在細菌內的分布范圍及作用目前卻知之甚少。有幾種方法可以檢測蛋白質的磷酸化。基于凝膠的試驗中，可以通過特殊染色或放射性標記，如33P 檢測磷酸化蛋白。在無凝膠分離試驗中，通過親和純化富集試驗樣品后，利用串聯質譜可以檢測到某些磷酸鹽殘基。這兩種方法都可以確定細菌內的磷酸化蛋白及磷酸化位點，如枯草芽胞桿菌，大腸桿菌、谷氨酸棒狀桿菌和肺炎支原體。每個研究均發現有63～79 個磷酸化的蛋白質，這表明磷酸化在細菌調控和動態變化過程中可能發揮著十分重要的作用。

糖基化是另一種翻譯后修飾，也是原核生物研究中的一個熱點課題。糖鏈的精確結構特征是目前研究中的一個巨大挑戰，目前很多研究還局限于糖蛋白的檢測。精確的糖蛋白結構鑒定仍然需要一些專業的技術，如核磁共振技術，基于質譜鑒定分析技術的發展，這些先進技術的發展才能為研究原核生物內糖基化多樣性及糖基化程度提供某些線索［10］。

3 宏蛋白質組學

大多數細菌蛋白質組學是對純培養的細菌進行研究。但是，自然界的細菌多生長在一個相互聯系的群落中，人們期待對這些細菌菌落間的相互作用及代謝交換作更深入的了解。作為標準蛋白質組學的一個自然延伸，宏蛋白質組學，也就是對細菌菌落進行全面整體蛋白質分析的一種研究方法。

長期來，基因組序列的限制和較低的蛋白質鑒定率阻礙了細菌群落的研究。全球第一個應用宏蛋白質組學研究的是對生長在加利福尼亞鐵山附近酸性礦山下水道中的自然生物膜菌群落的蛋白質組學研究［11］。通過鳥槍蛋白質組學方法從含量最多的前5 個物種中共鑒定了至少2000 種蛋白質。其中約48%的蛋白質來自于含量最高的有機體生物膜，即鉤端螺旋菌Ⅱ。該研究揭示了大量與氧化脅迫有關的蛋白質，表明氧化損傷是在富含金屬的酸性環境中生存的一個關鍵挑戰因素。對這個群落的后續研究表明:這些保護性蛋白是胞外多糖基質細胞的一部分，另外這些蛋白的濃度可能與生物膜的發育狀態有關。

Pan 等(2011)［12］用15N 標記方法研究了生物膜群落的蛋白質組學變化。因此，同位素標記技術可能是一項被用于跟蹤細菌群落中蛋白質周轉和表達的新技術。

目前，宏蛋白質組學技術上的限制仍然是缺乏復雜群落的基因組信息。但由于測序技術的發展，這種情況可能不會持續很久。宏蛋白質組學技術的另一個挑戰是群落的高度復雜性及某些群落物種信息的匱乏。

盡管如此，目前宏蛋白質組學研究所取得的成績還是令人鼓舞的，隨著技術的進一步發展，復雜群落的完整蛋白質組學分析乃觸手可及。

［1］JAFFE J D，BERG H C，CHURCH G M.Proteogenomic mapping as a complementary method to perform genome annotation［J］.Proteomics，2000，4(1):59－77.

［2］BAUDET M， ORTET P， GAILLARD JC， et al.Proteomics-based refinement of Deinococcus deserti genome annotation reveals an unwonted use of non-canonical translation initiation codons［J］.Mol Cell Proteomic，2010，9(2):415－426.

［3］DE SOUZA G A，ARNTZEN M O，FORTUIN S，et al.Proteogenomic analysis of polymorphisms gene annotation divergences in prokaryotes using a clustered mass spectrometry-friendly database［J］.Mol Cell Proteomics，2011，10(1):M110 002527.

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［12］PAN C，FISCHER C R，HYATT D，et al.Quantitative tracking of isotope flows in proteomes of microbial communities［J］.Mol Cell Proteomics，2011，10(4):M110 006049.