鐵皮石斛內(nèi)生真菌研究進(jìn)展△

方香香，張壽文

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

綜 述

2014年江西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)研究生創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目：鐵皮石斛內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)體系研究(JZYC14B08)

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張壽文，教授，研究方向：中藥資源與開(kāi)發(fā)；Tel：(0791)87118994，E-mail：hero220@163.com

鐵皮石斛內(nèi)生真菌研究進(jìn)展△

方香香，張壽文*

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

研究表明植物內(nèi)生真菌與植物之間形成互利共生的關(guān)系，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)次生代謝產(chǎn)物積累等功能。本文簡(jiǎn)要綜述了近年來(lái)鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離、多樣性、促生作用、誘導(dǎo)子效應(yīng)及生物活性等方面的進(jìn)展，為今后的相關(guān)研究提供參考。

鐵皮石斛；內(nèi)生真菌；多樣性；促生作用；生物活性

鐵皮石斛Dendrobiumofficinale是蘭科Orchidaceae石斛屬多年生草本植物，具有生津養(yǎng)胃，滋陰清熱，潤(rùn)肺益腎，明目強(qiáng)身等功效，《道藏》中將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛能增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血壓等功效[1]。由于其極高的藥用價(jià)值，鐵皮石斛野生資源被大量采挖，加上其特殊的生長(zhǎng)環(huán)境，鐵皮石斛的野生資源正瀕臨滅絕。有益微生物與植物組織外植體共同培養(yǎng)，植株的發(fā)育與代謝會(huì)發(fā)生變化，且植株對(duì)生物與非生物脅迫的抵抗力也會(huì)提高[2]。研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛種子萌發(fā)及其生長(zhǎng)有顯著地促進(jìn)作用，并且還能提高次生代謝產(chǎn)物含量。本文對(duì)近十幾年關(guān)于鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離、多樣性、對(duì)植株生長(zhǎng)的影響及生物活性等方面進(jìn)行綜述，并對(duì)鐵皮石斛內(nèi)生真菌研究前景進(jìn)行了展望。

1 內(nèi)生真菌的分離

在植物內(nèi)生真菌的分離過(guò)程中，除了盡可能保持組織的新鮮外，外植體表面的殺菌和分離培養(yǎng)條件是兩個(gè)關(guān)鍵因素。殺菌強(qiáng)度太大，不僅將表面微生物殺死，殺菌劑還可進(jìn)入材料內(nèi)部，殺死分布于表皮下的內(nèi)生真菌，使所分離的內(nèi)生真菌的種類(lèi)和數(shù)量受到影響；殺菌強(qiáng)度過(guò)低，又會(huì)使表面真菌混于內(nèi)生真菌中，造成分離失敗[3]，因此選擇合適的殺菌劑和殺菌時(shí)間非常重要。鐵皮石斛分離內(nèi)生真菌組織材料表面消毒有采用乙醇與升汞的組合，吳鳳慧[4]研究結(jié)果顯示用75%酒精處理30 s后再用0.1%的升汞溶液處理3 min鐵皮石斛，根段消毒徹底且分離菌株最多；也有采用乙醇與次氯酸鈉的組合，如75%酒精處理30 s再用3%次氯酸鈉消毒4 min[5]。

分離所用的培養(yǎng)基對(duì)真菌的種類(lèi)和數(shù)量也有影響，生長(zhǎng)緩慢和不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的真菌很難分離出來(lái)，因此有必要采取多種培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離。如用察氏培養(yǎng)基分離美花石斛內(nèi)生真菌，分離菌株比PDA培養(yǎng)基和麥麩糖培養(yǎng)基分離多，而PDA培養(yǎng)基和麥麩糖培養(yǎng)基分離出的菌株一樣[6]。鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離在培養(yǎng)基選擇上大多采用PDA培養(yǎng)基。PDA和FIM兩種培養(yǎng)基分離鐵皮石斛內(nèi)生真菌，所得的菌株不一樣，可能是因?yàn)镻DA和FIM所含的成分不同，真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)的偏好有所差異，而使得分離結(jié)果有所不同[4]。

2 內(nèi)生真菌的多樣性

鐵皮石斛內(nèi)生真菌種類(lèi)、數(shù)量和分布存在較大的多樣性，主要屬擔(dān)子菌門(mén)、半知菌門(mén)[7]和子囊菌門(mén)[8]中幾十個(gè)屬。胡克興和陳玉棟等[8-9]從鐵皮石斛不同組織中分離內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)根、莖、葉中均存在內(nèi)生真菌，但是菌株種類(lèi)、數(shù)量以及分布情況有所不同，其中根和莖部位的內(nèi)生真菌種類(lèi)和數(shù)量較葉多，鐮刀菌屬是優(yōu)勢(shì)種群。

內(nèi)生真菌的多樣性也存在于不同生長(zhǎng)環(huán)境間。毛益婷等[10]將兩個(gè)處于生長(zhǎng)期但不同生境中的鐵皮石斛營(yíng)養(yǎng)根內(nèi)生真菌進(jìn)行Simpson多樣性指數(shù)分析，顯示雅長(zhǎng)(0.984)地區(qū)鐵皮石斛內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)高于良山(O.965)，由于兩個(gè)地方鐵皮石斛的生長(zhǎng)環(huán)境不同，內(nèi)生真菌表現(xiàn)出不同的多樣性。

張麗[11]從鐵皮石斛栽培苗中分離出內(nèi)生真菌但無(wú)菌苗中沒(méi)有分離出，并且栽培苗中內(nèi)生真菌種類(lèi)和數(shù)量隨生長(zhǎng)年限的增長(zhǎng)而呈現(xiàn)增多趨勢(shì)。曹斌等[12]通過(guò)對(duì)營(yíng)養(yǎng)根組織解剖和顯微觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)小苗接觸栽培基質(zhì)才能觀(guān)察到菌絲。表明鐵皮石斛內(nèi)生真菌不是從一開(kāi)始就存在于植株內(nèi)，而是通過(guò)生長(zhǎng)環(huán)境中的栽培基質(zhì)進(jìn)入植物組織內(nèi)才形成的。由此可見(jiàn)生長(zhǎng)年限和栽培基質(zhì)也是鐵皮石斛內(nèi)生真菌多樣性的原因。

3 內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響

3.1 內(nèi)生真菌與植株共生培養(yǎng)

內(nèi)生真菌與鐵皮石斛組培苗共生，不論是地上部分植株還是地下部分根系生長(zhǎng)內(nèi)生真菌都有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，增加植株高度促進(jìn)長(zhǎng)出新芽和新根[13]。接菌苗與對(duì)照組相比，平均鮮重增長(zhǎng)率、大量和微量元素含量都有所增加[14-15]，葉綠素含量和N、K、P含量均比對(duì)照組高，內(nèi)源激素GA3(赤霉素)和IAA(吲哚乙酸)含量增加ABA(脫落酸)含量降低[16-17]。內(nèi)生真菌作為菌肥還能提高鐵皮石斛的存活率，顯著促進(jìn)植株生長(zhǎng)[18]。此外，鐵皮石斛內(nèi)生真菌與原球莖和種子共生對(duì)原球莖的生長(zhǎng)和種子的萌發(fā)也有促進(jìn)作用。高微微等[19]采用唇蘭小菇、石斛小菇、蘭小菇與組培苗進(jìn)行共生培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)三種內(nèi)生真菌均能促進(jìn)鐵皮石斛苗生長(zhǎng)，接種了石斛小菇和蘭小菇的鐵皮石斛原球莖增殖較明顯。吳慧鳳[4]共生培養(yǎng)結(jié)果顯示有四種菌株均不同程度地促進(jìn)了鐵皮石斛種子的萌發(fā)，菌株C22能極顯著的促進(jìn)作用原球莖的鮮重增長(zhǎng)率。鐵皮石斛內(nèi)生真菌還能促進(jìn)鐵皮石斛次生代謝產(chǎn)物的積累，增加多糖含量[20]。

雖然蘭科植物在自然條件下只有與內(nèi)生真菌共生才能正常生長(zhǎng)，但是并非所有的內(nèi)生真菌對(duì)植物都是有利的，有的是致病菌，與植物共生使植物不能正常生長(zhǎng)甚至死亡，有的則對(duì)植物生長(zhǎng)沒(méi)有任何影響，既不抑制也不促進(jìn)[21]。

3.2 真菌誘導(dǎo)子對(duì)植株生長(zhǎng)的影響

真菌誘導(dǎo)子是來(lái)源于真菌的一種特定化學(xué)信號(hào)，在植物與真菌的相互作用中，能引起植物細(xì)胞合成積累次生代謝物，對(duì)植物具有專(zhuān)一性[22]。它主要是真菌的細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)或分泌物，可以是真菌菌絲體、滅活菌絲體、發(fā)酵液和分泌物等。鐵皮石斛真菌誘導(dǎo)子的研究表明，真菌誘導(dǎo)子能促進(jìn)鐵皮石斛生長(zhǎng)[23]，并且受誘導(dǎo)子加入時(shí)間的影響表現(xiàn)出不同的作用，陳曉梅等[24]發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)后期加入真菌誘導(dǎo)子多原球莖生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，在培養(yǎng)前期加入則對(duì)原球莖生長(zhǎng)有抑制作用。真菌誘導(dǎo)子還對(duì)鐵皮石斛的化學(xué)成分有一定的影響。宋經(jīng)元[25]、楊慧[26]和陳曉梅等[27]研究表明真菌誘導(dǎo)子能促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物多糖和生物堿的積累，且誘導(dǎo)子制備方法、加入量、加入時(shí)期以及培養(yǎng)時(shí)間都會(huì)影響次生代謝產(chǎn)物的積累量[28]。另外陳曉梅等[29]HPLC-MS指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)真菌誘導(dǎo)子并沒(méi)有改變鐵皮石斛原球莖中的化學(xué)成分，但是能提高化學(xué)含量，而侯丕勇[30]采用薄層色譜和HPLC方法，結(jié)果顯示加入真菌誘導(dǎo)子后鐵皮石斛原球莖產(chǎn)生了7種新的化合物，其中3種是野生鐵皮石斛所特有的。

4 生物活性

研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛黑斑病菌AF-02和AF-04有抗菌活性，通過(guò)對(duì)6種病原微生物的抑菌試驗(yàn)，結(jié)果顯示其中的10株內(nèi)生真菌對(duì)至少1種指示菌具有抑菌活性[31]。從鐵皮石斛中分離出的石斛小菇的發(fā)酵液對(duì)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)有興奮作用，菌絲體和發(fā)酵液的粗提物能產(chǎn)生與中藥石斛相似的鎮(zhèn)痛作用[32]。此外，鐵皮石斛內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)HBsAg(乙肝表面抗原)[11]、HIV-1(人類(lèi)免疫缺陷病毒-1)[33]也有一定的抑制作用。

5 問(wèn)題與展望

目前，鐵皮石斛內(nèi)生真菌的研究主要集中在內(nèi)生真菌的分離、促生內(nèi)生真菌的篩選及誘導(dǎo)子作用這幾個(gè)方面，雖然已經(jīng)能夠分離出能有促進(jìn)作用的內(nèi)生真菌，但是將內(nèi)生真菌運(yùn)用到鐵皮石斛的規(guī)范化生產(chǎn)中還需要進(jìn)一步的研究，例如鐵皮石斛內(nèi)生真菌與組培苗共生培養(yǎng)的適宜條件，共生培養(yǎng)對(duì)鐵皮石斛質(zhì)量的影響，菌劑的開(kāi)發(fā)等等。另外，目前研究的主要對(duì)象還是鐵皮石斛植株，對(duì)內(nèi)生真菌本身的研究很少。許多報(bào)道表明內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性，例如從紅豆杉的樹(shù)皮中分離出的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生紫杉醇[34],桃兒七的莖韌皮部分離出一株能產(chǎn)生鬼臼毒素的內(nèi)生真菌[35]。微生物作為可再生利用資源，繁殖速度快且易保存，如果能從鐵皮石斛中分離出產(chǎn)生與宿主相同或相似作用的內(nèi)生真菌，再通過(guò)人工發(fā)酵的方法產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，這將為緩解鐵皮石斛資源短缺提供新的可能。

自然界中植物體內(nèi)存在多種微生物，這些微生物在植物生長(zhǎng)的過(guò)程中分別擔(dān)任著不同的角色來(lái)促進(jìn)植物種子萌發(fā)并長(zhǎng)成健壯的植株，所以單單只研究某一種微生物對(duì)植株的影響是不全面的。此外，植物體內(nèi)與之共生的微生物除了真菌以外還有細(xì)菌，有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌也能促進(jìn)鐵皮石斛組培苗顯著生長(zhǎng)[5]，因此內(nèi)生細(xì)菌的促生效應(yīng)也具有研究?jī)r(jià)值和意義。

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AdvancesinResearchofEntophytesfromDendrobiumofficinale

FANGXiangxiang,ZHANGShouwen*

(JiangxiUnivercityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Many studies have shown that endophytes forming a symbiotic relationship with plants could promote growth of plants and accumulation of secondary metabolites.The separation,diversity,growth-proving,inducer effects and biological activities of entophytes were reviewed in this article,which will provide reference for further study.

Dendrobiumofficinale;Endophytes;Diversity;Growth-promoting effect;Biological activities

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.020

2013-12-24)