土壤無機元素對當歸品質的影響△

王增繪，李文濤，黃林芳

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

專 題

國家自然科學基金(81274013)；國家自然科學基金重點項目(81130069)；人事部留學人員擇優資助項目(2009-2011)；國家重大科技專項創制新藥(2011ZX09307-002-01)

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黃林芳，副研究員，研究方向：中藥資源質量與評價；Tel：(010)57833197，E-mail：lfhuang@implad.ac.cn

土壤無機元素對當歸品質的影響△

王增繪，李文濤，黃林芳*

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的探討當歸品質與土壤中無機元素的關系。方法UPLC-PDA法測定甘肅、云南、四川和湖北4個主產區當歸藥材中阿魏酸、洋川芎內酯A、正丁基苯酞、藁本內酯和丁烯基苯酞含量。ICP法測定土壤中和藥材中16種無機元素。采用相關分析、主成分分析(PCA)及單因素方差分析方法分析探究藥材道地性與土壤中及藥材中無機元素之間的關聯。結果土壤無機元素對當歸品質有一定影響；不同產區土壤無機元素含量有差異。甘肅產當歸藥材中重金屬Cd與Pb含量顯著低于其他3個產地。As、Mn、Ba、Ca、Pb、Ni元素可能是影響藥材中5種主要成分含量相關的元素，Ca元素可能抑制了Cd元素的吸收。甘肅和云南產當歸主要活性成分含量相近，且高于湖北和四川。湖北和四川產當歸主要活性成分含量相似。結論甘肅與云南產當歸品質最優、四川和湖北產當歸質量差于甘肅和云南產當歸，體現了甘肅產當歸藥材的道地性。

當歸；土壤；無機元素；統計學分析；化學成分；品質

當歸藥材為傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，是臨床上常用中藥。當歸中主要化學成分有內酯類、生物堿類、有機酸類、酚類以及揮發油類等[2-4]。2010年版《中國藥典》將阿魏酸和藁本內酯作為當歸質量控制的標準。已有研究表明土壤中無機元素的含量影響當歸藥材的道地性[5-6]。當歸化學成分與當歸無機元素相關性的研究較少。本文測定當歸藥材中阿魏酸、藁本內酸、丁烯基苯酞、洋川芎內酯A、正丁基苯酞5種主要的化學成分、藥材中無機元素以及相應藥材生長地土壤中化學元素的含量。利用統計學中的相關分析、主成分分析的方法對三者之間的關系進行系統分析。探究了當歸藥材、土壤中無機元素含量特征以及藥材和土壤中無機元素與5種主要化學成分之間的關系，為無機元素對當歸藥材品質的影響以及當歸藥材道地性的評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

當歸樣品材料，見表1。土壤材料在當歸藥材采集的同時，刮取對應根上的土壤封裝于自封袋中。所采集的藥材樣品由中國醫學科學院藥用植物研究所標本館林余霖研究員，鑒定為傘形科植物當歸Angelica.sinensis(Oliv.)Diels。

表1 不同產地當歸樣品

1.2 材料處理

新鮮的當歸藥材根，用自來水清洗至表面無土，蒸餾水沖洗3遍后，再用去離子水沖洗3遍。沖洗好的樣品放置在托盤中，室溫自然晾干。藥材粉碎，過60目篩，粉末放置于錐形瓶中備用。取部分粉末于研缽中，繼續研磨，過80目篩放置自封袋中封存，供藥材中無機元素含量測定。土壤樣品放置在干凈的玻璃培養皿中，室內自然晾干后，置研缽中研碎，過100目篩，置自封袋中封存，供無機元素測定使用。

1.3 分析方法

1.3.1 當歸中5種主要化學成分提取和UPLC-PDA分析

取藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，即得。進液相前用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液備用。分別精密稱取阿魏酸(ferulic acid，1)，洋川芎內酯A(senkyunolide A，2)，正丁基苯酞(n-butylphthalide，3)，藁本內酯(ligustilide，4)，丁烯基苯酞(butylidenephthalide，5)各1.00 mg，置10 mL量瓶中，加70%甲醇至刻度，振搖使混合均勻，配制成混合對照品儲備液，備用。Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀-(PDA)二極管陣列檢測器。色譜柱：BEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 um)；柱溫：35 ℃，樣品室溫度4 ℃，流速：0.3 mL·min-1，提取檢測波長：261 nm，流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)梯度洗脫，0～4 min：5% B；4～7 min：5%-24% B；7～8 min：24%-28% B；8～10 min：28%-50% B；10～12 min：50%～70% B；12～14 min：70～100% B。

1.3.1.1 方法學考察

1.3.1.1.1 線性關系 分別精密吸取混合對照品儲備液100，200，300，400，500，600，700，800，900，1 000 μL至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進樣量2 μL，按上述色譜條件進行UPLC-PDA分析測定。以各標品濃度數值為橫坐標(X)，峰面積值為縱坐標(Y)進行線性回歸，得到各線性回歸方程。最小檢測限(LOD)和最小定量限(LOQ)定義為信噪比分別等于3(S/N=3)和10(S/N=10)時樣品濃度(見表2)。

1.3.1.1.2 重現性實驗 取同一批次的甘肅岷縣當歸樣品DG1，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測定，各對照品色譜峰的峰面積在0.61～2.89%范圍內，表明此方法的重現性良好。

1.3.1.1.3 精密度 取DG1樣品重復進樣6次，每次2 μL，測得各峰保留時間(RT)和峰積分面積(PA)。并計算RSD值，5個主要成分保留時間和峰面積RSD分別在0.24%～0.72%和1.07%～3.43%范圍內。

表2 阿魏酸及苯酞類成分的標準曲線方程及最低檢測限、定量限

1.3.1.1.4 穩定性實驗 取上述供試品溶液，放置0、2、4、8、12、24、36 h后分別測定和記錄峰積分面積，樣品濃度的RSD值在0.76%～2.25%范圍內，表明樣品在36 h內穩定。

1.3.1.1.5 加樣回收率實驗 取已測知含量的同一批次(甘肅岷縣-DG1)樣品6 份，每份約0.2 g，精密稱定，分別精密加入一定量(相當于樣品中的量)5種對照品，按供試品溶液的制備方法操作，按上述色譜條件測定。5種成分的回收率在98.33%～102.22%，RSD值在1.16%～4.72%之間。

1.3.1.2 樣品測定

提取處理好的供試品樣品溶液，直接進UPLC-PDA分析，單個樣品重復進3次，得到數據取平均值。

1.3.2 當歸藥材和土壤中無機元素的測定

參考JY/T 015-1996感偶合等離子體發射光譜方法通則標準，對藥材中和土壤中無機元素測定。精密稱量樣品1 g至石英消解管中，加入硝酸與鹽酸的混酸約4 mL，置于石墨加熱爐上，60 ℃消解12 h，然后提高到120 ℃趕酸2 h，定容到25 mL，取約20 mL溶液0.22 μm濾膜，進ICP(電感偶合等離子體發射光譜儀)分析。單個樣品測定3次，取平均值。

1.3.3 數據分析

應用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析、簡單相關分析；應用The Unscrambler 9.0軟件進行主成分分析。

2 結果

2.1 差異比較

2.1.1四地當歸主要化學成分差異 甘肅岷縣和云南鶴慶縣產當歸在5種主成分含量累積總量上明顯高于湖北房縣和四川中江縣，其中正丁基苯酞的含量在四地產當歸中含量差異相對其余4種成分差異較小(P=0.036，其余4種成分P<0.001為極顯著差異)較小，其余4種成分中甘肅岷縣和云南鶴慶縣的都明顯高于四川中江縣和湖北房縣(見圖1)。甘肅岷縣、云南鶴慶縣、四川中江縣和湖北房縣產當歸中阿魏酸含量的算術平均值為0.096%、0.141%、0.015%、0.005%；四地產當歸阿魏酸最大值分別為0.119%、0.150%、0.019%、0.060%，最小值為0.062%、0.136%、0.013%、0.005%。標準差分別為0.249、0.070、0.036、0.005；單因素方差分析表明，云南鶴慶縣當歸和甘肅岷縣當歸的阿魏酸含量高于湖北房縣和四川中江縣產當歸。阿魏酸作為當歸藥材質量控制的標準之一，2010年版《中國藥典》規定HPLC測定法其含量不少于0.05%。從四地當歸中阿魏酸的含量分析，可以看出甘肅岷縣和云南鶴慶縣當歸中阿魏酸含量都高于藥典標準，而湖北房縣和四川中江縣產當歸中阿魏酸含量則遠低于藥典標準，表明甘肅岷縣和云南鶴慶縣的當歸藥材合格。

四地產當歸5種成分PCA分析結果表明甘肅岷縣和云南鶴縣當歸差異較小，score plot結果顯示甘肅岷縣和云南鶴慶縣相距較近、湖北房縣和四川中江縣相距較近。Loading plot結果初步表明引起甘肅岷縣當歸、云南鶴慶縣當歸與湖北房縣和四川中江縣當歸差異的因子為阿魏酸、藁本內酯和丁烯基苯酞(見圖2)，與上述單因素方差分析結果顯示一致。

2.1.2 四地當歸藥材中無機元素差異 單因素方差分析結果顯示，Cd(P<0.001)、Ca與Ba元素在四地有顯著的差異P<0.01，Al與Pb元素在四地有顯著性差異P<0.05。其中當歸中Cd含量：湖北房縣>云南鶴慶縣>四川中江縣>甘肅岷縣，Pb含量：湖北房縣>四川中江縣>云南鶴慶縣>甘肅岷縣，Ca含量：甘肅岷縣>云南鶴慶縣>湖北房縣>四川中江縣，Ba含量:湖北房縣>四川中江縣>甘肅岷縣>云南鶴慶縣，Al含量：云南鶴慶縣>四川中江縣>湖北房縣>甘肅岷縣。

通過對四地產當歸中無機元素進行PCA分析，score plot結果發現4個產地表現出一定差異，但是湖北房縣、四川中江縣和云南鶴慶縣3個產地有交叉，不能通過無機元素分析很好的將4個產地區分開(見圖3)。

圖1 四個產地當歸藥材中5種化學成分含量

圖2 當歸藥材不同產地化學成分PCA分析

圖3 四個產地當歸藥材中無機元素PCA分析

2.1.3 四地土壤中無機元素含量差異

單因素方差結果分析顯示，四地當歸生長的土壤中大多數的無機元素為顯著差異和極顯著差異。Na和Ba元素在四地當歸中無顯著差異P>0.05，Cd和Pb元素表現顯著差異，其余的元素表現極顯著差異P<0.001。

通過對四地當歸生長地土壤無機元素PCA分析，score plot 結果表明4個產地表現出較明顯的差異(見圖4)。loading plot圖表明引起差異的因素，根據單因素分析結果大多數的元素含量有顯著或極顯著的差異，因而大多數的元素都是導致四地土壤性質明顯差異的因素。

圖4 當歸四個不同產地土壤中有機元素PCA分析

2.2 相關性分析

2.2.1 當歸主要化學成分與無機元素相關分析 當歸中阿魏酸與As、Mn元素呈現顯著正相關關系(P<0.05)；Ba元素與阿魏酸含量呈顯著負相關(P<0.01)；洋川芎內酯A與Mn元素呈顯著性正相關(P<0.01)，As、Ni元素與洋川芎內酯A呈顯著性正相關(P<0.05)；正丁基苯酞與Ca元素呈顯著性正相關(P<0.01)；藁本內酯、丁烯基苯酞與As和Mn元素呈顯著性正相關(P<0.05)，Pb元素與藁本內酯和丁烯基苯酞呈顯著性負相關(P<0.05)，Ba元素與藁本內酯和丁烯基苯酞呈顯著性負相關(P<0.01)(見表3)。

2.2.2 當歸中無機元素之間的相關性 Fe元素與Pb、Mn、Ni(P<0.05)和As、Al元素(P<0.01)呈顯著性正相關；Al元素與As、Cd、Ni、Ba(P<0.05)Pb以及Fe元素(P<0.01)呈顯著性正相關；Cd元素與Ca元素(P<0.05)呈顯著性負相關，與Pb、Al、Na(P<0.05)和Ni元素(P<0.01)呈顯著性正相關。As元素與Mn、Fe(P<0.01)和Al元素(P<0.05)呈顯著性正相關，B元素與Na(P<0.01)和Ba元素(P<0.05)呈顯著性正相關(見表3)。

表3 當歸藥材無機元素與化學成分之間相關性分析

注：*P0.05水平**P0.01水平,下同

2.2.3 土壤中無機元素與當歸中無機元素之間的相關性 藥材中Mn、Mg(P<0.01)、 Ca(P<0.05)3種元素的含量與土壤中該3種元素的含量呈顯著正相關。其中Mn元素與Cu、Fe、Ba、Al和Ni元素(P<0.05)元素呈顯著正相關；Ca元素與Cd、Cu、Zn、Mn元素(P<0.05)、Sn、Al元素和Cr元素(P<0.01)呈顯著性正相關；As元素與Cu、Zn、Fe、B、Ni元素(P<0.01)、Cr、Al元素和Mn(P<0.05)元素呈顯著性正相關；Pb元素與As、Ca(P<0.05)元素呈顯著性負相關；Cd元素與Ca、Mg元素(P<0.01)呈顯著性負相關(見表4)。

2.3 富集系數

藥材中元素含量總和與該元素在土壤中含量總和之比為富集系數。由當歸藥材富集系數可以看出，當歸只對Na元素表現出富集作用(見表5)。

表4 當歸藥材中無機元素與土壤中無機元素相關性分析

表5 當歸對無機元素的富集系數

3 討論

3.1 當歸藥材中5種化學成分含量評價

傳統研究觀點認為甘肅岷縣為當歸藥材的道地產區[7-9]。結合5種化合物含量分析和PCA分析，四地當歸5種主成分含量的差異分析結果支持了甘肅岷縣為當歸藥材道地產區的觀點。

3.2 當歸藥材中無機元素特征

《藥用植物及制劑外經貿綠色行業標準》(WMPT2-2004)中的藥材重金屬限量指標。As、Pb和Cd元素為有害人體健康金屬元素，本次所有當歸樣品中含量都低于該標準，從以上分析結果顯示甘肅岷縣產當歸藥材中這兩種金屬元素含量都是最低，符合綠色食品的理念和道地藥材的質量標準，支持甘肅岷縣產當歸是道地藥材的觀點。

3.3土壤中無機元素評價

依據《土壤環境質量標準》(GB15618-1995)，四地地土壤中Cd、Pb、Cr、Ni、Cu、Zn元素含量達到一級土壤環境質量標準值，因此4個產地的土壤都達到了國家一級標準。《國家中藥材生產質量管理規范》(GAP)中規定中藥材產地的土壤應符合土壤質量二級標準，故四地土壤均合格。

3.4 土壤中無機元素對藥材中無機元素和藥材中化學成分的影響

相關性分析結果表明，不同當歸樣品中的多數有相關的元素之間都呈現正相關關系，大多數有正相關關系的元素在植物吸收的過程中可能具有協同的作用，Cd和Ca元素呈顯著性負相關，推測Ca元素可能抑制了Cd元素的吸收。Mn、Ca和As 3種元素在藥材中的含量與在土壤中含量呈正相關，并且這3種元素與5種主要的成分間呈顯著性正相關；同時Ni元素在藥材中與Mn、As元素呈顯著正相關，因此我們認為Mn、Ca、As和Ni 4種元素對當歸藥材質量影響比較大。因此As、Mn、Ba、Ca、Pb、Ni元素可能是影響藥材中5種主要成分含量相關的元素。

本研究從有害金屬元素在土壤和藥材中含量差異、主成分含量差異以及土壤中無機元素與藥材中無機元素的差異和相關性等方面進行研究，得出的結果支撐了甘肅岷縣產當歸為道地產區藥材的論點。土壤系統為一個極為復雜的系統，藥材根際土壤中元素對藥材中成分的含量影響還需要更直接的實驗驗證，本研究為進一步深入研究提供了一定的參考。

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EffectsofInorganicElementsinSoilonAngelicasinensisQuality

WANGZenghui,LIWentao，HUANGLinfang*

(InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100093,China)

Objective：To investgate relationshi Pbetween the content of inorganic elements in soil and the quality ofAngelicasinensis.MethodsA total of 15 samples were analyzed.UPLC-PDA was used to determine the content of ferulic acid，senkyunolide A，n-Butylphthalide，ligustilide，butylidenephthalide inA.sinensis.The inorganic elements were determined by IC Pmethod.PCA method was used to discriminate different Angelica samples.One-way ANOVA and correlation analysis was used to find the relationshi Pamong the samples.ResultsThe differences of inorganic elements content inA.sinensisfrom Gansu and Yunnan are greater than that from Hubei and Sihcuan.The total content of five chemical components inA.sinensisfrom Gansu and Yunnan were higher than that from Hubei and Sichuan.The contents of Cd and Pb in Gansu were lower than that in the other three places.ConclusionThe quality ofA.sinensisfrom Gansu and Yunnan were much better than that from Hubei and Sichuan which support that，A.sinensisin Gansu is the genuine medicinal materials.

Angelicasinensis；Soil；Inorganic elements；Chemometrics；Chemical components； Quanlity

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.001

2013-10-23)