海洋來源真菌的抗腫瘤抗真菌活性篩選

陳修文 李長偉 賈國凱

(1. 湖南科技學院 生命科學與化學工程系，湖南 永州 425199；2. 軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

海洋來源真菌的抗腫瘤抗真菌活性篩選

陳修文1李長偉2賈國凱1

(1. 湖南科技學院 生命科學與化學工程系，湖南 永州 425199；2. 軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

目的：將深海來源的16株真菌經發酵培養與活性篩選，獲取活性菌株以供篩選藥源活性產物。分別經真菌普通培養基和人工海水培養基發酵獲得樣品，采用MTT法測試抗腫瘤活性，紙片法測試抗真菌活性。結果：菌株中有3株經過普通發酵培養基發酵和4株經過海水培養基發酵的樣品在100 μg/mL濃度下對K562細胞的抑制率大于60%；抗真菌活性測試中，僅有菌株16-02-1的發酵樣品對受試白色念珠菌ATCC 10231和土曲霉W-1均呈現一定的抑制活性。結論：深海來源真菌在不同培養基中發酵獲得的樣品，抗腫瘤活性各不相同，經過篩選獲得高活性菌株為尋找藥源活性產物提供了菌株。

深海來源真菌；抗腫瘤；抗真菌；MTT

海洋微生物包括海洋細菌、放線菌、真菌中發現了許多活性次級代謝物,其化學結構豐富多樣、新穎獨特，是陸地生物所不具有的[1]。這些活性次級代謝物大多具有很強的生理活性,包括抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗凝血、降壓等,具有廣闊的藥用前景[2]。活性菌株資源是活性次級代謝產物研究的物質基礎，而在生物活性篩選中大部分菌株并不表現出相應的生物活性而無法用于活性產物研究。本課題組在前期研究的基礎上摸索建立了無活性野生菌株轉化為活性突變株的技術方法，為拓展活性菌株資源提供了有效手段[3]。目前我們已通過相關技術手段對潮間帶來源的無活性放線菌和真菌進行了相關研究[4-6]，分離闡明了原始菌株不生產突變株新產的活性化合物[7]，取得了較好成效。鑒于此，為了進一步證實相關技術手段的廣泛適用性，我們對16株深海來源真菌進行了抗腫瘤活性篩選，一方面活性菌株可直接用于活性產物研究，而無活性菌株則可通過上述技術手段進行處理，使其轉化為活性突變株進而用于活性產物研究[7-11]。

1 儀器、材料和試劑

1.1 儀器

1360 B型超凈工作臺（北京亞泰科隆公司），日本Sanyo公司生產的MIR-253型微生物培養箱、MLS-3750型高壓滅菌器、MOV-212型干熱滅菌箱、MCO175型細胞培養箱，ZHWY-2102大型恒溫搖床（上海智城分析儀器制造有限公司），Labofuge 400R型離心機（德國賀力氏公司），VERSAmax-BN03152型酶標儀（美國 MD公司），AE31 EF-INV型倒置熒光顯微鏡（麥克奧迪公司），MILLI-Q純水機（millipor公司）。

1.2 材料與試劑

真菌：大洋一號采集的海洋真菌包括ZBY-1(69.7386°E，24.175°S，水深200米處海水)，ZBY-2(14°45'3"N，44°59'0"S，水深250米處海水)，ZBY-3(174.2170°E，24.3444°S，水深800米處海水)；深海 3000～4000m 采集的真菌包括3A03,3A09,3A11,3A17,3A22,3A23,3A24,3A25，海洋三所采集的深海真菌包括16-01，16-02-1，16-02-3，16-02-5，19-01。

真菌PDA培養基：葡萄糖 2%、瓊脂 2%、NaCl 1.5%，20%的土豆水煮液配制。

真菌普通液體培養基（1#）：葡萄糖 2%、麥芽糖 1%、甘露醇 2%、谷氨酸 1%、蛋白胨 0.5%、酵母浸粉 0.3%，蒸餾水1000 ml (pH 6.0)。

人工海水發酵培養基(2#)：甘露醇 20%、麥芽糖 20%、葡萄糖 10%、味精 10%、KH2PO40.5%、MgSO4·5H2O 0.3%、酵母浸粉3%、玉米漿1%、海水素 33.4%、蒸餾水1000 ml。

細胞與細胞培養基：人白血病K562細胞（本研究所李松教授提供）、RPMI-1640培養基（美國 Gibco公司，Lot No.1403238）、胎牛血清（北京圣瑪生物技術研究所）。

試劑：MTT試劑（美國Amresco公司，批號0793）、青霉素（華北制藥股份有限公司產品，批號 070201））、鏈霉素（美國 Amresco 公司，批號0558）。其他試劑均為分析純試劑。

2 實驗方法

2.1 菌株的傳代培養

16株深海真菌采用PDA培養基，挑取適量孢子在平板培養基上劃線，28℃培養，每天觀察菌落生長情況，待孢子生長成熟，用固體平板培養基反復劃線傳代3次后，接種于試管斜面培養基上，4℃冷藏并適時傳代。

2.2 發酵培養與樣品制備

將16株深海來源真菌在28℃活化培養3～5天后，刮取孢子適量，分別接種在兩個各含200 mL普通液體培養基和200 mL海水液體培養基的500 mL三角燒瓶中，于28°C、200 rpm搖床發酵9～10天。另取各真菌孢子適量，分別接種在含25 mL普通液體培養基的80 mL試管中，于28°C、210 rpm搖床發酵11～15天。根據各菌株生長狀況適時終止培養，下搖床得發酵液。發酵液中加體積比2倍量的丙酮，超聲破碎菌體，離心取上清液，減壓濃縮至不含丙酮，冷凍干燥，得各菌株的發酵提取樣品。精密稱量適量樣品，用80%的甲醇配成10 mg/mL的樣品溶液，供抗腫瘤活性測試。

2.3 抗腫瘤活性測試

MTT法[7,9]抗腫瘤活性測試 取對數生長期的K562細胞，用新鮮RPMI-1640培養基配成細胞密度為1×105個/mL的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200 μL，37℃培養1 h后每孔加樣品溶液2 μL，繼續培養24 h。培養結束后在光學顯微鏡下觀察細胞形態變化，判斷有無細胞凋亡或細胞壞死的形態特征，必要時拍照。各加入MTT 20 μL，37℃孵育4 h。處理結束后于4℃、2000 rpm條件下離心20 min，吸去上清液，每孔各加150 μL DMSO，置酶標儀上充分振蕩使MTT紫色產物完全溶解，測量每孔570 nm處的OD值。實驗中全部測試樣品均設三個孔，取OD平均值，以空白對照組為100%按下式計算抑制率（IR%）：IR% = (OD空白-OD樣品)/OD空白×100%。

2.4 抗真菌活性測試

采用8 mm紙片法[12]，以5 mg·mL-1制霉菌素為陽性對照，測定各菌株發酵物萃取樣品對致病菌的抑制活性。分別吸取菌懸液100 μL均勻涂布于PDA平皿上，制備被試菌平板。再取對照和樣品溶液各15 μL吸附于已經干法滅菌（170 oC，2 h）后的濾紙片，將該濾紙片貼于涂有致病菌的PDA培養基上，28 oC培養3～5天，若有活性則其周圍不會有菌落生長，即形成抑菌圈。根據抑菌圈直徑判斷樣品的抑菌活性強弱。

3 結果

3.1 抗腫瘤測試結果

表 1 深海來源真菌野生發酵樣品100 μg·mL-1對K562細胞的抑制活性測試結果

3.2 抗真菌測試結果

1#和 2#發酵樣品對白色念珠菌的活性測試中，發現僅菌株16-02-1發酵樣品對受試白色念珠菌ATCC 10231和土曲霉W-1呈現一定的抑制活性， 1500 μg/片普通培養基發酵樣品對ATCC 10231和W-1的抑菌圈分別為21 mm（與15μg/片的制霉素相當）和14 mm，但同劑量的海水培養基發酵樣品對ATCC 10231的抑菌圈直徑僅為16 mm，而對W-1則未顯示出明顯抑制作用。

4 討論

16株深海來源真菌的普通培養基與人工海水培養基發酵樣品對K562細胞的抑制活性顯示較為顯著的差別（結果見表 1），其中普通培養基發酵呈現高活性的部分菌株（如ZBY-1和16-02-5，其IR%分別為87.7%和83.6%）在用海水培養發酵時只呈現中等強度抗腫瘤活性（IR%分別降至50.2%和61.1%）；而用海水培養基發酵時呈現高活性的部分菌株（如19-01和3A22，其IR%分別為89.8%和89.7%）在改用普通培養基發酵時則只呈現較低抗腫瘤活性（IR%降至22.0%和32.8%）。抗真菌活性測試中，菌株16-02-1的1#和2#發酵樣品對受試白色念珠菌 ATCC 10231和土曲霉 W-1均呈現一定的抑制活性，但是二者所呈現的抑菌活性強度也具有較大差別。

上述結果提示，在深海真菌菌株活性篩選過程中培養基不同會導致其發酵產物活性產生較大差別，且大多菌株在經多次傳代和不同批次發酵后，所得樣品生物活性波動較大，與陸地或普通海域來源真菌相比，次級代謝相關遺傳穩定性比較差，但同時也篩選獲得了活性測試結果比較穩定的強活性菌株和無活性菌株。其中部分無活性菌株可供開展上述次級代謝改造相關研究，而包括16-02-1在內的部分活性菌株則可用于直接開展活性產物研究。

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Antitumor and antifungal activities screening of deep sea sediment derived fungi

CHEN Xiu-wen1,2, LI Chang-wei2, JIA Guo-kai1

(1.Department of Biology and Chemistry, Hunan University of Science and Engineering, Yongzhou Hunan 425199, China; 2. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China)

Abstrat: Objective:To investigate metabolites of sixteen strains isolated from a deep sea sediment for obtaining the bioactive metabolite producing strains. Methods:Sixteen fungi were fermented with ordinary medium and artificial seawater medium. Antitumor and antifungal activities were tested by MTT and paper-disc methods, respectively. Results There are 3 fungal strains fermented by ordinary medium among them inhibited the proliferation of K562 cells with the inhibition rates over 50% at the 100 μg/mL of concentration, samples from 5 fungal strains fermented by artificial seawater inhibited the proliferation of K562 cells with the inhibition rates over 40% at the 100μg/mL of concentration, only Strain 16-02-1 revealed both antitumor and antifungal activities. Conclusions:The results indicated that the production have different inhibitive femented in different medium, and obtain strains with high activity source for finding the active drug product provides strain.

fungus from deep sea sediment; antitumor; antifungal; MTT

Q5-3

A

1673-2219（2014）05-0080-03

2014－01－05

國家自然科學基金（81172976）資助。

陳修文（1987－），男，湖南永州人，湖南科技學院助教，碩士，研究方向為天然藥物開發。

(責任編校：何俊華)