順鉑對人胃癌SGC7901細胞株中干細胞的影響

許 浪 (武漢科技大學醫學院，湖北 武漢 430061)

腫瘤組織中存在極少量具有無限自我更新能力和多向增殖潛能的細胞，即腫瘤干細胞(CSC)，它們不僅在腫瘤的形成、發展和轉移方面起著重要的作用，也可能是腫瘤耐藥及抵抗放化療的根源〔1，2〕。Nanog基因作為全能性或多能性干細胞標記物，在胚胎干細胞和包括肺癌、胃癌在內的多種 CSC中表達〔3，4〕。本研究旨在揭示順鉑干預人胃癌SGC7901細胞后，對胃癌干細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞株SGC7901由武漢大學生命科學院惠贈。小鼠抗人Nanog多克隆抗體(Cell signaling公司)，SP-9000免疫組化試劑盒及DBA顯色試劑盒(北京中山金橋生物技術有限公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培養基、胰酶(Gibco公司)，Transwell小室(Corning公司)。

1.2 細胞培養 人胃癌SGC7901細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，該培養基不含抗生素，5%CO2，37℃的細胞培養箱中常規傳代培養。

1.3 體外順鉑干預 將細胞接種于96孔板，分為實驗組和對照組。實驗組第2天加順鉑，先通過MTT計算出加入順鉑作用72 h的IC50(7.22 μg/ml)，接種6孔板，第2天加入順鉑至終濃度5 μg/ml(低于IC50濃度)，72 h后收取細胞做后續實驗。無藥物干預作為對照組。

1.4 Hoechst33342染色法 檢測順鉑對SGC7901細胞中SP細胞的比例的影響。藥物干預完成后，倒掉舊的培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3～5次，加入新的培養液，再加入Hoechst33342至終濃度為5 μg/ml，37℃避光孵育90 min，倒掉舊的培養液，加入新鮮培養液1 ml，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照(隨機選取5×200倍視野，分別計數100個細胞，計算SP細胞所占的比例)。重復6次。

1.5 免疫細胞化學 將兩組細胞分別爬片處理，PBS沖洗，冷丙酮固定10 min。按SP-9000試劑盒步驟檢測Nanog。用已知陽性的精原細胞切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作陰性對照。隨機選取5×200倍視野，分別計數100個細胞，計算陽性細胞所占的比例。重復6次。

1.6 Transwell體外侵襲實驗 利用Transwell小室進行SGC7901細胞體外侵襲力的測定:4℃溶解Matrigel，每孔50 μl加入預冷的Transwell小室的上室中，胰酶溶解消化細胞，用含1%牛血清白蛋白的培養液調整細胞密度至1×106ml－1，每孔200 μl加入各孔上室。余下按使用說明操作，完成后隨機于100倍光鏡下取上、下、左、右中心5個視野，計算穿膜細胞，取其平均數。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗。

2 結果

2.1 順鉑干預后SGC7901細胞中SP細胞的比例Hoechst33342染色后，熒光顯微鏡下可見SP細胞的胞核較大，呈圓形或橢圓形，淡然或者低染。與對照組(2.43%±0.62%)相比，實驗組SP細胞比例(5.54% ±1.66%)增高(P＜0.05)。

2.2 順鉑干預后Nanog表達 對照組Nanog蛋白主要表達在胞質，染色細胞少且弱，核內少見表達。而實驗組細胞表達增多且強，核表達細胞數目增多。實驗組 Nanog蛋白表達(79.15% ±10.33%)較對照組(55.23% ±3.67%)明顯增高(P＜0.05)。

2.3 順鉑干預后SGC7901細胞侵襲力 實驗組穿膜細胞數〔(63±8)個〕較對照組〔(42±7)個〕明顯增多(P＜0.05)。

3 討論

現階段，化療仍然是臨床治療胃癌的主要手段之一。雖然化療的方案各有不同，但大多含有順鉑。目前化療的效果并不理想，一般只能短期控制肺癌的發展，無法根治胃癌，而且由于后期往往產生明顯的耐藥性，胃癌細胞可能出現加速生長，很快發生侵襲轉移等現象。CSC學說的確立為腫瘤的研究和治療帶來了新的理念〔5，6〕。CSC在腫瘤的異質性中處于“塔尖”的位置，與耐藥性的形成也有著密切的關系〔7〕。Pan等〔8〕證實，肺癌CSC比腫瘤內其他成熟癌細胞對化療更具有抗藥性，導致化療方案無法徹底治愈肺癌。類似的結果還在肝癌等腫瘤中得到證實〔9〕。

Nanog是目前公認的CSC標志性基因，其表達與CSC的自我增殖等能力密切相關。在乳腺癌、結腸癌、肺癌的研究中都證明〔10〕，Nanog與CSC的關系密切并影響著這些腫瘤的生物學行為、轉移、復發、治療及預后，Nanog在CSC中的表達明顯高于腫瘤內其他成熟癌細胞。腫瘤中Nanog高水平表達者往往進展快、易發生轉移，預后差。

本研究說明相比于普通的胃癌細胞，CSC對以順鉑為代表的化療藥物有更強的耐受性。CSC的存在與腫瘤化療的耐藥性有著密切的關系。推測順鉑只能有效殺死普通胃癌細胞，而對CSC沒有明顯殺傷作用。因此，用藥后CSC反而以更快的速度生長，表現為比例的增加，表現出明顯的惡性腫瘤生物學特性，提示其參與了耐藥性的發生。但胃癌耐藥性的發生是否完全歸咎于CSC，需要進一步研究。

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