分子生物學技術在中醫證候研究中的應用探討

牛曉紅

(中國中醫科學院醫學實驗中心，北京 100700)

分子生物學是從分子水平去探討人類生命規律的一門學科。近年來，基因工程制藥、基因治療法等分子生物學技術的廣泛應用，在各個領域均取得了理想的效果。但在中醫臨床和基礎研究中，如何科學地將分子生物技術運用到中醫證候、中藥作用機制等相關研究中，發揮中醫藥的優勢已成為中醫藥工作者不斷思考和探索的關鍵問題。隨著人們對于中醫藥的重視，許多研究人員運用現代化的新觀念和新技術開始對中醫藥進行研究，并已成功地將分子生物技術運用于中醫證候研究中，這將有利于從分子水平去研究中醫理論、疾病的發生發展規律以及有針對性地研制中藥，更好地發揮中醫辨證施治的臨床作用，從而更好地為人類健康服務。

1 中醫證候與分子生物學理論層次高度關聯

中醫是我國醫學界的重要分支，治療過程中主要以辨證施治和加減藥物治療為主，在臨床上取得了理想的效果，這也成為中醫賴以生存和發展的基礎，這兩個基礎均依賴于中醫證候。從中醫角度來說，“陰陽失調，百病叢生”，許多疾病的發生均由陰陽失調所致，察陰陽而調之也成為中醫臨床診斷、治療的基本原則和基本方法。中醫認為腎是人的根本，它決定了人的生長、發育、體質、疾病等，但是其先天因素又同樣受到后天因素的影響和調節。從現代分子生物學角度來說，一個人基因是其生存和發育的主要因素，它決定人的生老病死，但是基因又不是全部，它同樣受到人類的生活、環境、習慣等影響。綜上所述，兩者在概念上存在著許多相似之處，這也為從分子水平對疾病的本質進行深入探討指明了新的發展方向。而從分子角度對疾病進行研究分析，能填補中醫證候微觀還原分析的一些空白之處，因此醫學界利用分子生物學理論和技術研究中醫證候便顯得至關重要。

2 分子生物學技術發展使中醫證候實質研究成為可能

從中醫角度來說“有諸于內必形諸于外”，這句話的意思就是當人內在功能等發生紊亂時，必然在人的外表中體現出來，通過外部彰顯內在的聯系，這樣就能夠通過外在去尋找內在的證候，從基因的多態性演變為分子的聯系性。自分子生物學技術誕生后，可以通過分子生物學技術手段對人體的一些疾病證候、健康狀態等進行研究，發現人當前狀態和基因表達譜上存在的差異，從而說明不同證候狀態下分子生物學層次的差異。換言之，應用分子生物學技術研究同一疾病的不同證候和同一證候不同的疾病，以及同一個體不同狀態等之間的基因差異，能夠找出其共同點和不同點，針對基因突變和異常表達與疾病的關系進行分析，為中醫證候研究提供分子生物學基礎，同時為中醫異病同治、同病異治等理論提供有力的依據。另外，隨著分子生物學技術的飛速發展，利用分子生物學技術能夠研究細胞內基因表達，而基因表達是通過DNA控制蛋白質的合成來表現的。因此，分子生物學對于蛋白質研究在技術上的突破將為證候與蛋白質的結合研究奠定基礎。在這一方面，有關蛋白質芯片的深入研究、納米技術的使用，將為蛋白質的研究、中醫證候的研究提供發展的契機[1]。

3 中醫證候特征與基因多態性研究

中醫證候是機體在疾病發展過程中的某一階段的病理概括，眾多學者認為中醫證候與現代醫學疾病必然有其內在的本質聯系,尤其體現在基因組學領域。利用分子雜交、聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性技術(PCR-RFLP)、分子克隆、基因工程等分子生物學技術使基因診斷和基因治療得以實現，而芯片技術的出現又使它們在快速、準確等方面得以提高。隨著分子生物學技術的發展及對中醫證本質認識的深入,中醫證候研究已經從癥狀、體征為主體發展到目前的分子基因水平。

中醫證候具有整體性、時空性、傳變性和個體差異4個特征。許多基因具有的多態性變化與某些疾病的發生有密切相關性，而某一病癥的不同中醫證候發生頻率在一定范圍內的分布則是相對穩定的，中醫臨床證候的多樣性和復雜體系正好是基因多態性與臨床表型多樣性關系的最好研究對象[2]。近年來，在證候的基因多態性研究中也取得了一些成果。如唐發清等[3]報道了高血壓病肝陽上亢證與酪氨酸羥化酶(TH)基因擴增有關。歐陽濤等[4]研究發現，ApoE第一內含子增強子BxpL1位點的G/G基因型可能是冠心病及冠心病痰證及痰瘀互阻證的易感基因之一。陳衛衡等[5]通過ApoAI、B基因多態性與非創傷性股骨頭壞死證候相關性研究發現，ApoAI基因啟動子-75bp位點多態性、啟動子-內含子位點多態性及ApoB基因XbaI基因型，與非創傷性股骨頭壞死證候分型有一定相關性。謝毅強等[6]通過2型糖尿病大血管病變患者脂代謝紊亂與ApoE基因多態性及中醫證候的研究發現，2型糖尿病大血管病變患者的血脂隨著病情的加重和病程的延長存在不同程度的異常,各種中醫證候之間脂代謝的差異與ApoE基因的多態性有一定關系。這些研究結果提示，疾病有關基因多態性與中醫證候多樣性及發生頻率的規律性間可能存在某種關聯。

4 中醫臨床與分子生物學

臨床上利用分子生物學技術對相關疾病基因進行干預和分析，從而有效地探討中藥作用的分子機理與作用靶點。吳志奎等[7]研究顯示，補腎生血藥(方藥組成：山茱萸、熟地黃、龜板膠、阿膠等藥物組成)能有效提高貧血患者體內的血紅蛋白和抗堿血紅蛋白，提高血紅蛋白的珠蛋白鏈比值，其作用機理可能是補腎生血藥能提高珠蛋白鏈γ/β+γ比值,促進γ-珠蛋白基因的轉錄和表達,誘導HbF合成,從而代償β-珠蛋白基因功能的缺陷。謝金錦等[8]研究了補陽還五湯對球囊擴張主動脈后再狹窄其內皮血小板衍化生長因子的影響，實驗結果顯示，補陽還五湯能夠增加人體動脈內皮SOD-1基因表達，有效地改善血灌注供氧能力，同時這種中藥還能夠有效地抑制血小板衍化生長因子受體的mRNA表達，從而控制細胞等病理性繁衍、增殖等。從分子生物學角度可以看出，補陽還五湯能夠有效地調節人體平衡，而并不是簡單的單因子作用。張國強等[9]利用分子生物學技術對丹參治療狼瘡性腎炎效果及其影響等進行了研究，實驗結果顯示，丹參能夠有效地抑制人體腎臟纖維等相關細胞的增殖，并能夠提高C-myc蛋白高水平而誘導細胞死亡。因此，臨床在治療狼瘡性腎炎及肝硬化等疾病時丹參能夠發揮重要作用。

5 中藥與分子生物學

分子生物學技術自創立以來在醫學中廣泛使用，在中藥相關領域中的應用也越來越受到重視。

5.1 分子生物學技術在中藥作用機理研究中的應用

中藥是臨床上使用較多的一線藥物，患者用藥后藥物能夠直達病灶，有效地緩解病情。但醫學界對于中藥的作用機理并不完全知曉，隨著分子生物學技術在中藥研究中的不斷應用，能夠有效地探討中藥的作用機理?；颊叻弥兴幒?，中藥的作用環節和生命分子之間存在或多或少的聯系，當中藥發揮作用時必然會引起遺傳信息的改變，而決定其改變基礎的則是基因。根據近年來的相關研究結果初步顯示，中藥的作用與其生物活性成分調控基因的表達有關。我國科研人員曾對人參、黃芪、淫羊藿、靈芝等藥物在人體細胞因子中調控人體免疫功能等進行實驗[10]。曹穎英等[11]在研究淫羊藿甙促進小鼠脾細胞IL-3mRNA及IL-6mRNA的表達中發現,患者服用中藥后，藥物能夠有效地誘導淋巴細胞IL-3mRNA、IL-6mRNA等遺傳基因的表達，且藥物的促進作用與患者藥物劑量關系密切。陳記藩等[12]進行了1項實驗，實驗中采用分子生物學技術研究通痹靈，結果顯示，中藥能夠降低患者體內mRNA水平，通痹靈在治療過程中能夠有效地抑制滑膜細胞內異常升高的TNF-αmRNA表達，降低TNF-αmRNA水平。唐咸玉等[13]用半定量逆轉錄-聚合酶鏈反應 (RT-PCR)方法測定各組大鼠心肌N-rasmRNA的含量，發現ras癌基因在心肌肥厚形成發展過程中起到一定作用， 中醫活血祛痰治法可逆轉心肌肥厚， 其治療機理可能是抑制了心肌ras原癌基因的高表達。

近年來采用基因芯片技術對中藥復方進行了研究,以往采用傳統研究方法僅限于中藥復方某一方面或幾方面的作用研究,很難對該復方有全面的認識,尤其是對新功能的認識和開發。而應用基因芯片技術能夠迅速了解該復方對基因組中某些基因表達的影響,從而不僅了解該復方的原有功能,還有可能很輕易地發現該復方組方后可能出現的新功能,為復方的新功能開發提供客觀依據。

5.2 分子生物學技術與中藥資源

近年來，隨著我國醫療技術的飛速發展，分子生物學技術在中藥資源等方面也做出了杰出的貢獻。當前，我國很多野生中藥資源都瀕臨滅絕，且很多人工栽培的中藥品質不高，使得臨床使用中成藥存在很大困難。因此臨床上采用藥用植物轉基因等技術能夠對相關植株進行良種繁殖，有效地提高藥材質量，并能夠獲得化合物能力更強的突變植株。胡之璧等[14]應用植物細胞培養技術進行洋地黃培細胞的生物轉化研究，篩選出高產細胞并獲得了相當好的遺傳穩定性。另外已培養出抗癌活性成分三尖杉酯含量高于原植物的三尖杉培養細胞[15]。研究發現栝樓中的天花粉蛋白強烈抑制HIV病毒和很多其他病毒，具有顯著的臨床效果，其需求量日益增大，現在其編碼基因已被克隆，并在大腸桿菌中高效表達。分子生物學技術的發展使利用轉基因動物獲得像麝香、牛黃、犀牛角等一些動物性中藥成為可能，從而大大節省了資源，保護了這些瀕危的動物。

5.3 分子生物基因芯片技術在中藥篩選和新藥研發中的應用

隨著醫療技術的飛速發展，我國基因研究也進入到后基因時代，在后基因時代的中藥、證候研究中，隨著基因結構和功能研究的突破，致病基因的發現，藥物的研究目標之一是在基因水平上尋找藥物靶標，通過比較藥物處理前后細胞基因表達的差異來推測篩選藥物作用的靶標，從而找到“導向藥物”。目標之二是用基因芯片技術檢測藥物的毒性或副作用，進行毒理研究。而生物芯片技術所具有的高集成與組合化學相結合，為新藥研究的初篩提供超高通量篩選。

Clarke等[16]采用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達情況,發現絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達增加。該研究提示,這類研究既有助于闡明藥物的作用機制,也有助于確定藥物作用的靶基因,篩選出有效中藥及其有效成分，為新藥研究提供線索。隨著芯片技術的不斷發展以及在藥物開發、靶標尋找等方面的廣泛應用，將有利于確定中藥的有效活性成分和有效活性部位，為開發中藥新藥提供一個簡便、快捷的新途徑。

6 結語

綜上所述，中醫證候實質的揭示已成為制約中醫藥現代化研究和發展的瓶頸之一。然而，中醫證候特征與基因多態性理論在理論層面給予了我們許多具有探索價值的啟示，特別是分子生物學技術的發展，使我們從分子生物學角度解釋中醫證候實質成為可能，許多學者的探索也取得了階段性進展。但相關研究仍處于初級階段，臨床上對于中醫證候的認識還不十分完全，因此中醫證候及中藥作用機制等方面的研究尚需我們進一步的探討和完善。

[1] 趙燕平，趙燕琴.分子生物學在中醫藥學中的應用情況及前景探討[J].浙江中西醫結合雜志，2001，11(9):529-531.

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[3] 唐發清，金益強,鄢東紅，等.高血壓病肝陽上亢證絡氨酸羥化酶基因多態性分析[J].湖南中醫學院學報，2000，20(2)：3-4.

[4] 歐陽濤，宋劍南，李林，等.冠心病痰瘀證候與載脂蛋白E第一內含子增強子基因多態性關系的研究[J]. 中國中醫基礎醫學雜志，2005,11(6)：414-417.

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[6] 謝毅強，王華，吳月平，等. 2型糖尿病大血管病變患者脂代謝紊亂與ApoE 基因多態性及中醫證候的研究[J]. 中華中醫藥雜志，2011，26(1)：144-146.

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[9] 張國強，葉任高，孔慶瑜，等.丹參對狼瘡性腎炎成纖維細胞增殖、凋亡及C-myc蛋白表達的影響[J].中國中西醫雜志，1997，17(8):473.

[10] 陳蘇紅，王小紅，王升啟.中藥影響細胞基因表達的研究進展[J].中國中藥雜志，2000，25(9):515.

[11] 曹穎英，鄭欣岳，張國慶.淫羊藿促進小鼠脾細胞IL-3mRNA及IL-6mRNA的表達[J].第二軍醫大學學報，1998，19(2):199-200.

[12] 陳記藩，沈曉燕，趙慧芳，等.通痹靈對佐劑性關節炎大鼠滑膜細胞TNF-αmRNA表達的影響[J]. 中國中醫基礎醫學雜志,1999, 5(5):19-21.

[13] 唐咸玉，王劍，嚴燦，等.活血祛痰法對高血壓左心室肥厚大鼠心肌ras原癌基因表達的影響[J].中醫研究，2001，14(1)：14-16.

[14] 胡之璧．傳統藥材和現代生物學技術 [J]．上海中醫藥大學，上海市中醫藥學研究院學報， 1996～1997：96.

[15] 胡之璧．三尖杉培養細胞抗癌活性成分的研究 [J]．植物學報， 1995， 37(6):417.

[16] Clarke PA George M,Cunningham D, et al. Analysis of tumor gene expression following chemotherapeutics of patients with bowel cancer [J/OL], Nat Am Inc. http://llgenetics. nature. com,1999.