動物慢性腦缺血模型的研究現狀

王麗曄，陳志剛，羅玉敏

(1.首都醫科大學宣武醫院，北京 100053；2.北京中醫藥大學附屬東方醫院，北京 100078)

慢性腦缺血是指大腦整體水平的血液供應減少(低于40～60 mL/100 g/min)的狀態，是臨床常見病、多發病。慢性腦缺血初期表現為頭暈頭重，且無血管性或其他腦器質性病變的明確提示，故臨床診斷與治療均具有一定的難度。但長期處于慢性腦缺血狀態可使腦組織產生慢性缺血，呈現大腦皮質萎縮、神經元變性、腦白質疏松、膠質細胞增生等一系列病理改變，導致認知功能下降，進而發展為癡呆或其他腦血管病。慢性腦缺血被認為是Alzheimer病、血管性癡呆(vascular dementia, VD)、Binawanger病、缺血性卒中等多種疾病發生發展過程的一個重要環節。對其診斷及治療的研究刻不容緩，本文就慢性腦缺血動物實驗中的模型、評價及常見問題予以綜述，為慢性腦缺血的進一步研究提供參考資料。

1 模型制作

慢性腦缺血的常見動物模型有大鼠、小鼠和兔等模型。其中鼠類較其它哺乳動物更易獲得，且容易飼養，繁殖快，抗感染能力強，因而深受現代研究者的青睞。

1.1 大鼠慢性腦缺血模型的制作

大鼠腦血管除缺失大腦前交通動脈外，其余結構與人類基本相同，均由前循環頸內動脈系統及后循環椎基底動脈系統構成，前后循環通過Willis環相互溝通，保證腦部供血。且大鼠價格低廉、來源充足、實驗條件較好控制，是目前制作慢性腦缺血模型的常用動物。但因其頭顱體積較小，血管造影等操作具有一定難度，且鼠的腦缺血代償能力不同于人類，故不能完全等同于人類慢性腦缺血狀態。

大鼠慢性腦缺血模型可分為血管閉塞、動靜脈瘺及控制血管直徑等方法。血管閉塞方法提出較早，方法多樣，操作簡單，應用廣泛。動靜脈瘺及控制血管直徑方法應用較少，操作相對復雜。

1.1.1 血管閉塞法： 血管閉塞分為2～4條腦血管閉塞的不同方法，因前循環提供腦部2/3的供血，后循環供血相對較少，故我們常選擇結扎前循環血管，如頸總動脈或頸內動脈，后通過后循環代償及側枝循環建立，造成慢性全腦缺血；或前循環與后循環結扎配合，但損傷程度較大，操作具有一定難度；因后循環供血區域較小，單純結扎后循環易于代償，故多不采用。

1.1.1.1 兩血管閉塞法(2-vessel occlusion，2-VO)：目前認為就慢性腦缺血模型中，兩血管結扎法所致腦損傷動物間可比性較強，穩定性最佳，適合長期慢性病程及輕度腦缺血的研究，亦被認為是造成慢性低灌注及白質損傷最常用的模型[1]。

1992年Torre JC[2]首次采用永久性結扎Wistar大鼠雙側頸總動脈法(permanent occlusion of bilateral common carotid arteries，BCCA)制作出慢性腦缺血的動物模型，即將大鼠麻醉后同時結扎雙側頸總動脈，是目前公認比較好的慢性腦缺血模型。由于海馬對于缺血非常敏感，損傷后常引起學習記憶功能下降，故該模型亦為VD最常用的模型[3]。該法優點是操作簡便，重復性好，缺血程度基本相同，有較好可比性，大鼠學習記憶能力降低顯著，而無神經功能缺損癥狀，有利于慢性病程的研究觀察[4]，是慢性腦缺血研究中常用模型[5-6]，在小鼠慢性腦缺血模型中也可見該方法研究[7]。腦血流監測顯示雙側頸總動脈堵塞2.5 h后，皮質和海馬的血流量減少25%～50%；術后7 d，血流量仍顯著減少，為正常水平的60%～75%，并且維持這個水平至少幾個月。但該模型具有一定的缺陷，頸總動脈供血區域廣泛，同時結扎雙側頸總動脈，對動物急性損傷較大，易導致動物死亡，且頸總動脈供應眼動脈血流，對視功能具有明顯損害，對行為學結果的影響不容忽視。

2002年Sarti等[8]認為BCCA可能過急過快的減少了血流，引起的急性損傷較嚴重，對該法進行改良，先行單側頸總動脈結扎，1周后再行對側頸總動脈結扎，先后兩次麻醉及創傷，較傳統方法感染機會增大，應注意抗感染藥物的應用，但該法可以降低大鼠術后的病死率，漸漸在研究中被應用[9]。

因頸總動脈閉塞后對視功能的影響，雙側頸內動脈閉塞的方法應運而生，在1997年由Ohta等[10]提出，于頸內動脈的翼腭動脈分支之上節扎頸內動脈，消除了對視覺的損害，對于需要保留完善視覺系統功能的模型，此方法具有較大優勢。但針對此模型的應用及研究較少，無論是在腦缺血程度還是病變范圍均與BCCA模型不盡相同，對本模型的評價還需要進一步的研究。

Horeck[11]于2009年提出了采用閉塞兩條血管造成三條腦內血管供血阻斷的頭臂干聯合左側頸總動脈閉塞法，即采用微侵襲胸腔外先閉塞頭臂干，同時結扎左側頸總動脈。閉塞頭臂干，可導致右側頸總動脈及右側椎動脈閉塞，聯合左側頸總動脈閉塞，可導致前循環和部分后循環血流阻斷，造成全腦缺血。該法操作復雜，對大鼠損傷較大，廣泛應用具有一定難度。

1.1.1.2 三血管閉塞法(3-vessel occlusion，3-VO)：3-VO法指閉塞一條頸總動脈及兩側椎動脈或者兩條頸總動脈及一條椎動脈。3-VO的缺點是需要直接暴露基底動脈，手術創傷大，在手術中對周圍組織、神經牽拉較嚴重。

3-VO術后即表現出明顯腦缺血狀態，缺血量會減少85%左右，與急性全腦缺血相似。從血管解剖學及血液供應情況推測，3VO為再灌注恢復最快者，9周后缺血將會被完全代償，恢復到正常水平，故該模型更適合急性全腦缺血性疾病損傷的研究。

Hans-Jorg Busch[12]認為一側頸總動脈及雙側椎動脈閉塞是最好的模型制作方法，先通過脊椎旁通路閉塞雙側椎動脈，1 h后閉塞一側頸總動脈。該方法可有效降低腦血流量，且不造成組織損傷。研究顯示隨著適應性調節及顯著的側枝循環代償，術后1周同側腦血流量即增加39%，3周后增加72%。

閉塞兩側頸總動脈和一側椎動脈也是3-VO的常見方法。Motonomu[13]于1985年提出，先通過枕部最長肌終止處3 mm × 3 mm的骨窗電灼切斷椎動脈，隨后結扎雙側頸總動脈。此模型急性缺血亦明顯。故后期對此方法改良[14]，先電灼左側椎動脈，同時結扎右側頸總動脈，1周后再結扎左側頸總動脈，此法可降低急性腦缺血程度，減少對慢性腦缺血病理生理過程的干擾，從而延長慢性腦缺血時間，便于各種干預手段的實施及成效判定。此改良方法產生的慢性腦缺血損害迅速、確切、重復性好，局部腦血流量在術后腦皮質和海馬可減至正常的85%和62%，9周左右腦供血基本恢復。

1992年Torre JC[2]提出結扎左鎖骨下動脈及雙側頸總動脈制作慢性腦缺血動物模型，因左鎖骨下動脈供應左側椎動脈血流，故間接形成左側椎動脈及雙側頸總動脈閉塞。首先行喉部至劍突做一切口，剪斷前四根肋骨，結扎左鎖骨下動脈，在暴露縫合雙側頸總動脈，縫合后實現模型制作。該模型避免對椎動脈的直接操作，但需剪斷肋骨暴露左鎖骨下動脈，故損傷易較大。

1.1.1.3 四血管閉塞法(4-vessel occlusion，4-VO): 四血管結扎法即閉塞兩條前循環供血動脈及雙側椎動脈，該模型動物在8周內持續明顯的腦灌注降低，但由于動物椎動脈與脊管前動脈間的交通支脈存在，個體差異較大，且手術過程復雜，動物死亡率較高。

雙側椎動脈電凝合并雙側頸總動脈反復夾閉法是目前國際公認血管性癡呆的造模方法。首先灼斷雙側椎動脈，24 h后用微動脈夾行雙側頸總動脈反復夾閉，雙側同時夾閉5 min，松開30 min，重復3次。術后8～12周腦血流量趨于穩定，但海馬區未達到正常的腦供血量，形成慢性大腦缺血，適于亞急性的研究。但該模型兩次手術，手術復雜，創傷較大，死亡率較高。

文獻報道稱三步四血管結扎法可明顯降低動物的病死率，且模型的穩定性，可復制性均較好。因分次閉塞椎動脈會增加動物的頸部感染風險和手術應激反應，可采取[15]先閉塞雙側椎動脈，再分次閉塞雙側頸總動脈方法，間隔為1周。還有先閉塞雙側椎動脈，再依次閉塞雙側頸內動脈的方法，雖行為學上可出現學習記憶能力下降[16]，但此法仍被認為未表現出持續明顯的動物認知功能的降低。

1.1.2 動靜脈瘺造模法: 動靜脈瘺慢性腦缺血模型主要是由于血流動力學改變而導致相應供血區腦灌注壓降低，同時引流靜脈壓升高而導致局部腦組織灌注回流障礙引起的非梗死性慢性腦缺血。根據吻合方式不同，分為動靜脈遠端的端一端吻合模型和動靜脈端一側吻合模型。

1989年Morgan等[17]首次嘗試將大鼠右側頸總動脈和頸外靜脈的近心端結扎，并將其遠心端行端端吻合，使顱內動脈和靜脈發生分流；Bederson[18]將大鼠頸總動脈近心端與頸外靜脈遠心端吻合，殘端結扎，致使頸總動脈的血液經吻合口流入頸外靜脈，可使平均動脈壓、腦灌注壓和大腦中動脈血流速度均明顯下降；2002年Hai[19]采用右側頸外靜脈、頸總動脈端側吻合和雙側頸外動脈及對側橫竇引流靜脈結扎的方法，易可導致腦缺血，均可制作慢性腦缺血模型。

1.1.3 控制血管直徑造模法:控制血管直徑[20]是通過將血管與注射器針頭系緊后拔出針頭以減小血管直徑，該方法能保留腦血管，對腦部損傷較小，且可定量控制血管狹窄程度。曾有報道稱該模型在術后2 h血流量明顯降低，1 d后開始恢復，30 d左右基本恢復正常，其時程及血流量的減少程度與動脈狹窄的程度有關。

血管閉塞法、動靜脈瘺造模法及控制血管直徑的方法均是在慢性腦缺血模型制作中的常用方法，各有其優缺點，血管閉塞方法效果直接、明顯，應用廣泛，但局部牽拉刺激明顯；動靜脈瘺造模法操作復雜，對大鼠損傷較大；控制血管直徑方法研究較少，對針頭直徑與慢性腦缺血時程關系還有待于進一步研究。研究者可根據自己的研究目的選擇模型制作方法。

1.2 小鼠慢性腦缺血模型的制作

小鼠模型因其后交通動脈發育不完整，與人類解剖結構具有較大區別，故其應用相對少，隨之模型制作種類亦少。常見的為右側頸總動脈閉塞模型及微線圈模型。

右側頸總動脈閉塞(right unilateral common carotid artery occlusion，rUCCAO)模型是由日本學者提出[21]，其認為頸部多發大血管狹窄或閉塞所致的慢性缺血情況與臨床情況有一定差別，在2-VO基礎上提出rUCCAO模型。此模型與臨床中單發血管狹窄所致的慢性腦缺血更接近，且該模型在研究慢性腦缺血炎性反應、認知障礙以及腦白質損傷方面具有一定的應用價值，對闡明血管性癡呆，尤其是皮質下缺血性癡呆的病理生理學機制有一定的作用。同時，該模型的動物死亡率較低，血流量減低較明顯，對研究慢性腦缺血后炎性與抗炎反應的變化等方面都有一定的價值。

Shibata等[22]在實驗中采用鋼琴弦制作內徑0.16～0.22 mm的微彈簧圈，通過纏繞雙側頸總動脈造成雙側頸總動脈狹窄，制作慢性腦缺血模型。此模型為可控性，與大鼠控制血管直接模型的原理相同。該模型對皮質損傷較輕，同時對視通路的影響較小。但目前關于該模型的研究報道較少，其應用價值有待進一步研究。

1.3 其它動物

家兔易于飼養、性格溫順、繁殖率高，但是大腦皮質不夠發達，效果不理想。豬的腦血管形態和生理特征以及代謝方面與人類相似，且側枝循環少，較適合于腦血管病的研究，但體型龐大，品系不純，故未廣泛應用。狗的腦皮質較發達，且抗手術打擊能力強，但狗的腦血管與人有較大差異，且其頸內-外動脈間有非常豐富的吻合網，單根顱內動脈阻塞很難形成穩定的腦梗死灶。猴的腦解剖和生理特征、對藥物的反應及代謝都和人類很相似，是研究人類神經系統疾病的理想動物，但由于其價格昂貴、不易飼養和來源困難等，從而限制了其被廣泛使用。

2 模型評價

2.1 總體評價

術后大鼠出現精神萎靡，反應遲鈍，神情呆滯，站立不穩，少食，少飲等表現，3～5 d后精神逐漸恢復，1周時基本正常，但仍比較遲鈍。

2.2 行為學評價

行為學檢測是模型評價的重要手段，具體方法的選擇主要根據慢性腦缺血后的癥狀表現。當慢性腦缺血涉及后循環時，后循環對前庭供血相應減少，出現眩暈癥狀。對此可通過眩暈潛伏期的測定，判斷術后動物狀態。將大鼠置于200 r/min的旋轉誘導儀上旋轉1 min，后置于底部帶電周圍絕緣的實驗箱內，并即刻電擊。大鼠從旋轉停止至跳上橡膠柱逃避電擊，并在橡膠柱上保持30 s定為眩暈潛伏期。潛伏期越長提示眩暈越嚴重。曾有實驗記載，于頸總動脈結扎后8周、12周、16周測定眩暈潛伏期，結果顯示眩暈潛伏期與術后時長呈正相關。

慢性腦缺血隨著病程進展，會出現記憶力下降，故記憶功能的評價也是慢性腦缺血模型常用的評價方法。測定學習記憶功能的方法主要有Morris 水迷宮試驗、Y-迷宮試驗、跳臺試驗、穿梭箱訓練等。Morris水迷宮和Y-迷宮常用于研究動物的空間學習記憶，跳臺試驗、穿梭箱試驗等屬于操作式條件反射。

Morris水迷宮(Morris water maze， MWM)是慢性腦缺血研究中常用的記憶能力評價方法，主要用于測試實驗動物對空間位置覺和方向覺(空間定位)的學習記憶能力。實驗主要包含定位航行實驗和空間探索實驗，分別對大鼠的學習能力及記憶能力進行評價。慢性腦缺血模型動物游泳速度正常，但找不到平臺，或者時而出現攀爬行為，或者沿著迷宮側壁轉圈，進而逃避潛伏期長，游泳距離長，說明大鼠的學習記憶能力差，學習記憶受損嚴重。在水迷宮的搜索策略上，正常大鼠經過訓練學習后，基本呈現為直線式的尋找平臺策略；而慢性腦缺血大鼠呈現周圍式和隨機式，游過路程明顯延長，亦表明其對于空間學習的能力明顯下降。Yi Shu[23]利用Morris水迷宮將2-VO1周、4周、8周進行對比，訓練2d后2-VO組逃避延遲明顯高于假手術組，于目的象限的時間亦明顯減少，而4周和8周兩組之間無明顯差異。

Y迷宮是一種短時空間辨別學習記憶測試，又可同時檢測動物的主動回避反應和被動回避反應，是檢驗動物學習記憶特點的常用工具，但Y迷宮對動物的懲罰如電擊本身帶有刺激性，對動物完成學習記憶任務有一定的干擾。實驗結果表明，正確學習記憶功能大約為電擊18～20次，術后12周大鼠正確學習記憶成績為電擊(39.5±4.3)次，16周為(58.3±5)次。可見慢性腦缺血大鼠學習記憶能力下降。

跳臺試驗原理是利用大鼠在開闊的空間通常在邊緣與角落里活動。將動物放在平臺上后，它會跳下平臺并向四周進行搜索，但空間底部鋪以通電銅柵，動物跳下平臺將受到電擊，其正常反應是跳回平臺以躲避傷害性刺激。多數動物可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺。訓練5 min，記錄每只大鼠首次跳上平臺所需的時間(反應時間)和5 min內受到的電擊次數(錯誤次數)，作為學習成績。24 h后重復上述試驗，記錄每只大鼠首次跳下平臺的時間(潛伏期)和錯誤次數，作為記憶成績。慢性腦缺血大鼠學習成績中的反應時間和錯誤次數明顯增多，記憶成績中的潛伏期時間較學習時顯著減少，但錯誤次數明顯增多。

穿梭箱法、八臂輻射迷宮及識別物體測驗也均是監測動物記憶水平的常用方法，文獻報道2-VO術后穿梭箱失敗的比例升高；在2-VO術后6個月和1年進行的輻射臂迷宮測試提示后期大鼠空間學習能力下降是因為低灌注引起的永久性神經損害；2-VO術后60 d和90 d行識別物體測驗，發現2-VO的鑒別指數下降，提示其視空間學習能力及非空間記憶能力均受到損害。

以上方法均為評定慢性腦缺血記憶損害的常用方法，在研究不同模型的作用機制及藥物治療效果有不同的意義，故在研究中都有涉及。

2.3 神經電生理改變

有關慢性腦供血不足模型神經電生理改變的研究報道相對較少，其中腦電圖(electroencephalogram，EEG)的監測更常見。

用腦電圖觀察到半數的2-VO實驗動物在急性期腦波幅度先開始下降，然后節律逐漸消失，術后300～400 sEEG上顯示為一條等電線[24]。腦低灌注后急性期神經電生理活動消失可能與缺血閾有關，隨著腦血流逐漸下降，少血變成缺血時神經元的電活動將受到影響。給2-VO模型視網膜閃光刺激，可以從枕葉皮質記錄到視覺誘發電位[25]。在2-VO模型術后10 d，記錄到P2波，波峰潛伏期增加，幅度減少。這可能是由于腦低灌注使視網膜、視神經和視束廣泛損害，因此皮層神經元的電位活動減低，不容易被記錄。研究還發現在2-VO術后，一側海馬CA3區受到電刺激，可以在對側海馬CA1區記錄到刺激誘發的群峰電位，術后80-150 min誘發的群峰電位幅度迅速下降甚至記錄不到，但是這種情況是可逆的。但在術后3 d，誘發的群峰電位與假手術組無明顯區別。對于這種現象目前有兩種解釋：盡管神經元突然死亡，可能是代謝適應機制，CA1區錐形細胞的電活動不受影響；2-VO術后第2天海馬的血流已經開始恢復，促使錐形細胞的功能恢復[26]。Farkas E等[27]通過EEG技術驗證該模型在癡呆形成中的作用。EEG作為臨床常見檢查設備，在人類慢性腦缺血的研究中應用更為廣泛[28]。

在神經電生理研究中P300的測定也逐漸被大家重視。由于P300電位在事件相關電位中具有特殊意義，被稱為“認知”電位，受到了學者們廣泛注意，大量的臨床研究亦發現并證實，在認知功能損害的有關疾病中，P300潛伏期和波幅亦發生相應改變，為有認知功能損害疾病的診斷和評估預后提供了一個重要客觀的輔助手段。因P300潛伏期的改變，較其他檢測指標出現早，因而越來越多地應用于癡呆的早期發現及診斷上。結合慢性腦供血不足記憶力的下降及與血管性癡呆的密切關系，理論上慢性腦缺血不足的動物P300潛伏期將會延長，但是暫無就此實驗的相關描述。

2.4 監測腦血流量

在慢性血管源性腦缺血模型中，我們常檢測腦血流量(cerebral blood flow，CBF)來確定動物的低灌注狀態，在慢性腦缺血模型中，腦血流量的監測更是動物狀態的“金指標”。

以2-VO模型為例，2-VO術后在不同時間點不同腦區的腦血流變化不同。2-VO模型一旦建立，腦血流速度會迅速下降，下降最明顯的部位是皮層和白質，海馬次之，一直持續到術后4周，在術后8周到3個月腦血流下降速度減緩[29]，術后6個月時的腦血流變化與對照組無明顯區別。說明2-VO術后腦血流變化可根據代謝和組織穩態分成3個時期：從血管結扎開始到術后2～3 d為急性期，此期腦血流變化非常明顯，開始時腦血流迅速下降，以后持續在較低水平，出現缺血缺氧狀態，影響神經組織的電生理變化；術后8周到3個月為慢性期，腦低血流轉為慢性狀態，腦糖代謝也下降，這一期與人類老齡化和VD狀態形成的腦血流下降極其相似；3個月以后為恢復期，此期腦血流逐漸恢復到基線水平，腦低灌注和異常狀態的代謝逐漸停止。

在目前研究中，多用CBF評定模型質量及治療效果，如Zhang X等[30]人通過CBF觀測針灸對癡呆的治療機制。

3 常見問題

3.1 鼠齡的選擇

動物年齡與慢性腦缺血損傷程度及恢復時間密切相關，Sivilia S[31]將3月齡成年鼠與12月齡老年鼠進行比較，發現在2-VO術后8d，成年鼠海馬區出現神經再生，同期老年鼠無該反應，提示年齡在神經功能恢復中起決定性作用。目前關于慢性腦缺血模型動物年齡的比較中，多見于大鼠及小鼠研究，不同年齡各有其不同意義。如有學者應用此模型對出生后1 d的SD大鼠幼崽進行研究[32]，Gong H[33]對年輕大鼠行雙側頸內動脈結扎模型觀察其變化，結果顯示在術后7 d可見大腦后部及部分海馬血管功能性區域下降，而14 d后基本恢復正常，提示年輕鼠恢復較快，考慮與血管新生及神經可塑性相關。中年鼠[34]的研究顯示其損傷較年輕鼠嚴重，尤以皮質、海馬神經退行性病變為甚。而老年鼠因其細胞死亡率高，修復能力弱，所產生的功能損害表現最早且最嚴重，但其死亡率亦因此升高。研究認為血管內皮功能障礙[35]是老年鼠損害程度大的原因之一，也在一定程度上導致老年人慢性腦缺血的高發病率。故研究者應根據自己實驗目的及思路選擇適當年齡大鼠。

3.2 常見模型致死率對比

雙側頸總動脈同時進行結扎(BCCA模型)，對動物急性損傷較大，故24 h病死率高。據此開創出間斷結扎雙側頸總動脈的改良法，可以明顯提高動物的存活率，Cechetti F等[36]研究對比BCCA法該方法可明顯提高術后3月動物存活率。但該法兩次結扎間斷1周，對于慢性腦缺血的形成過程具有一定的影響，不排除最終損害減輕的可能。相對而言，三血管及四血管結扎因椎動脈的參與，使局部損傷及整體損傷程度明顯升高，且因椎動脈閉塞致腦干供血減少，導致生命中樞受抑制。但總體比較而言，頸內動脈代替頸總動脈結扎[15]及間斷結扎均能明顯提高生存率。

4 結語

慢性腦缺血因其高發病率及與血管性癡呆的密切關系倍受關注，近年來對其機制及藥效的研究不斷增多，但目前研究尚不夠深入。對于模型構建無統一標準，致使后續研究無法同向比較；模型不夠完善，存在死亡率高、模型不穩定等因素；模型評價方法相對復雜，增加實驗難度。隨著研究的深入，旨求明確慢性腦缺血機制，并研制合適藥物有效作用于靶點，減輕其癥狀及延緩其進程。

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