氯胺酮、咪達唑侖復(fù)合麻醉對大鼠認知功能的影響

趙艷梅 楊麗梅 李 倩 陳 寧

(武警后勤學院防護醫(yī)學教研室，天津 300309)

全身麻醉后大腦發(fā)生基因表達〔1〕、β淀粉樣沉積〔2〕、神經(jīng)元凋亡〔3，4〕等廣泛而持久的變化，單純的短時間麻醉即可造成實驗動物長時間的認知功能障礙〔5～7〕，臨床上稱為術(shù)后認知功能障礙(POCD)，表現(xiàn)為認知能力異常、記憶受損、焦慮、人格改變、精神錯亂等，嚴重者可出現(xiàn)癡呆，其確切機制不明。本文探討氯胺酮、咪達唑侖復(fù)合麻醉后對大鼠認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 雄性Wistar大鼠16只，SPF級，體重180～220 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號SCXK-(軍)2007-004。氯胺酮(連云港恒瑞制藥公司，批號KH050201)、咪達唑侖(江蘇恩華藥業(yè)集團有限公司，批號20090211)；Y迷宮(張家港市生物醫(yī)學儀器廠)；DY-89 Ⅱ型電動玻璃勻漿器(寧波新芝生物科技股份有限公司)；RNA提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；TaKaRa RNA PCR Kit AMV3.0(大連寶生物工程有限公司)；100 bp DNA MarkerⅠ、GoldView核酸染料(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)；瓊脂糖(Sigma)，引物合成由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2大鼠模型制備及分組 雄性Wistar大鼠隨機分為兩組，對照組和麻醉組，每組8只，麻醉組參照文獻〔8〕給予腹腔注射氯胺酮75 mg/kg、咪達唑侖5 mg/kg進行麻醉誘導。麻醉起效時間以翻正反射消失為標準。以大鼠前爪不能自行翻轉(zhuǎn)為俯臥位，且維持時間≥10 s作為大鼠前爪翻正反射消失的標準。對照組腹腔注射等體積的生理鹽水。

1.3麻醉誘導對大鼠認知功能的影響(Y迷宮實驗) 動物適應(yīng)環(huán)境3 d后在安靜的暗室內(nèi)用Y迷宮測定。Y迷宮箱底為銅柵間隔，每臂末端有信號燈，燈亮時箱底的銅柵無電流，提示為安全區(qū)。每次測試均在同一時間段進行，測試時調(diào)節(jié)刺激電壓以保證大鼠在10 s內(nèi)逃避跑動，大鼠受電擊后直接跑到安全區(qū)為正確反應(yīng)，否則為錯誤反應(yīng)。每次大鼠跑至安全區(qū)后持續(xù)光亮30 s，繼而轉(zhuǎn)換燈光進行下一次測試，燈光出現(xiàn)的方位按照隨機次序變換，直至連續(xù)10次中有9次正確反應(yīng)即為達到學會標準。兩組動物麻醉后繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，每日繼續(xù)進行Y迷宮實驗，于第7天迷宮實驗結(jié)束后處死動物，觀察麻醉誘導對大鼠認知功能的影響。

1.4麻醉誘導對大鼠海馬N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體(NR)1、NR2B基因表達的影響 Y迷宮實驗結(jié)束后立即斷頭處死大鼠，于冰臺上分離雙側(cè)海馬，立即裝入EP管中置于液氮保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)NR1(GenBank NM_017010.1)、NR2B(GenBank M91562.1)和β-actin (GenBank NM_031144)cDNA序列，采用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計引物，序列如下：正義鏈：Sense：5′-TCGGTATCAGGAATGCG-3′，反義鏈：5′-GGTGCTCGTGTCTTTGG-3′；NR2B：正義鏈：5′-GCTCAGCGACCTGTATGG-3′，反義鏈：5′-TCGTCACTGCGTTCTTTGT-3′；β-actin：正義鏈：5′-CTGAGAGGGAAATCGTGCGT-3′，反義鏈：5′-TGGAAGGTGGACAGTGAGGC-3′。PCR反應(yīng)條件如下：循環(huán)條件：94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 45 s；34(β-actin為30)個周期，產(chǎn)物長度：NR1 328 bp，NR2B 381 bp，β-actin 448 bp。RNA提取方法按照試劑盒說明書進行。擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀下觀察結(jié)果，圖像采用Image J分析軟件進行處理。以目的基因條帶的綜合光密度與β-actin基因條帶綜合光密度的比值作為目的基因的相對含量。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠麻醉誘導一般狀況觀察 大鼠在整個麻醉誘導實驗中，狀態(tài)平穩(wěn)，無豎毛、易激惹、流涎、呼吸急促等現(xiàn)象，實驗動物均無死亡現(xiàn)象發(fā)生。麻醉起效時間(翻正反射消失時間)為(2.08±0.32) min，<5 min，自然復(fù)蘇時間為(65.12±9.25) min，說明腹腔注射氯胺酮75 mg/kg和咪達唑侖5 mg/kg可誘導產(chǎn)生可靠的麻醉復(fù)蘇動物模型。

2.2麻醉誘導對大鼠認知功能的影響 麻醉組與正常對照組相比，正確反應(yīng)次數(shù)顯著下降(7.88±1.25 vs 9.63±0.52，t=3.787，P=0.002)。提示氯胺酮、咪達唑侖復(fù)合麻醉對大鼠短期(1 w)學習記憶能力有一定損害作用。

2.3麻醉誘導對 NR1、NR2B基因表達的影響 麻醉組與正常對照組相比，大鼠海馬組織內(nèi)NR2B mRNA表達量顯著降低(66.36±12.33 vs 100±0,t=4.14，P=0.001)，NR1 mRNA表達量無明顯變化(97.61±9.05 vs 100±0,t=0.89，P=0.67)。說明氯胺酮、咪達唑侖復(fù)合麻醉可降低海馬部位的NR2B的mRNA表達，對海馬內(nèi)NR1的表達無明顯影響。

3 討 論

NR是海馬參與學習記憶功能的一個重要受體。氯胺酮是一種NR的非競爭性拮抗劑，它主要通過作用于NR門控的離子通道中PCP 位點，減少NR通道開放時間和頻率，從而阻斷各種刺激后產(chǎn)生的長時程增強效應(yīng)(LTP)效應(yīng)，干擾學習記憶過程〔9〕。王丹等〔10〕給小鼠注射較大劑量的氯胺酮(10～20 mg/kg)后發(fā)現(xiàn)小鼠記憶功能受到損害，并且這種損害作用似呈劑量依賴關(guān)系。劉毓和等〔11〕的研究表明，氯胺酮對老年大鼠認知功能有短暫的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)注射麻醉劑量的氯胺酮〔12〕或小劑量氯胺酮〔13〕可對大鼠認知功能產(chǎn)生損害，新生1周齡大鼠腹腔注射一次氯胺酮即可出現(xiàn)空間辨別學習記憶能力下降，其機制可能與NMDA2受體和谷氨酸轉(zhuǎn)運體蛋白I 的改變有關(guān)〔14〕。多項臨床研究也發(fā)現(xiàn)，氯胺酮依賴患者存在明顯的認知功能損害〔15，16〕。由此可見，應(yīng)用氯胺酮可能引起大腦學習記憶功能的變化，從而導致術(shù)后認知功能障礙的發(fā)生。

研究發(fā)現(xiàn)，鎮(zhèn)靜劑量的咪達唑侖可以抑制大鼠的記憶獲得和鞏固并維持較長一段時間〔17〕，大鼠腹腔注射咪達唑侖可出現(xiàn)東莨菪堿所致的認知功能障礙加重的現(xiàn)象〔18〕，因此認為咪達唑侖可能也是導致術(shù)后認知功能障礙的一個重要因素。

海馬是NR的富含區(qū)域，NR 的這幾種亞型在海馬都有表達，但以NR1、NR2A及NR2B為主。NR與學習記憶密切相關(guān)，其中NR2B與之最為密切〔19〕。本研究說明氯胺酮、咪達唑侖復(fù)合麻醉可降低海馬部位的NR2B的mRNA表達，提示海馬組織內(nèi)NR2B表達下降可能與認知障礙的產(chǎn)生關(guān)系密切，該結(jié)果與以往研究相一致〔20，21〕。

由于學習記憶是一個十分復(fù)雜的神經(jīng)活動過程，涉及多個腦區(qū)、多種神經(jīng)遞質(zhì)、細胞內(nèi)信號分子和基因表達等因素，除了谷氨酸遞質(zhì)系統(tǒng)外，還涉及膽堿能系統(tǒng)和其他遞質(zhì)系統(tǒng)，存在多個受體及蛋白分子之間的相互作用，具體氯胺酮和咪達唑侖如何影響認知過程，通過哪些信號分子起作用，尚有待于進一步深入研究。

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