內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與心肌缺血再灌注損傷

趙建榮 牛春雨 趙自剛

(河北北方學(xué)院微循環(huán)研究所，河北 張家口 075000)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是真核細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，它可以正確地折疊蛋白質(zhì)三維空間構(gòu)象、儲存Ca2+、合成膜蛋白及分泌蛋白，并參與膽固醇及脂質(zhì)的生物合成，在哺乳動物相關(guān)信號通路中起著至關(guān)重要的作用。ER的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是實(shí)現(xiàn)其功能的基本條件。ER如果發(fā)生錯誤的蛋白質(zhì)聚集、Ca2+耗竭或超負(fù)荷、脂質(zhì)合成紊亂、蛋白質(zhì)糖基化形成障礙或蛋白質(zhì)不能形成正常的二硫鍵等均可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，這一亞細(xì)胞病理過程稱為ER應(yīng)激(ERS)。細(xì)胞為了生存，產(chǎn)生針對ERS的反應(yīng)，稱為ERS反應(yīng)，一般用未折疊蛋白提示ER發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)。近年來對于ERS反應(yīng)的研究愈來愈多，ERS在多種疾病(如心血管疾病、糖尿病、帕金森病、病毒感染性疾病等)的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用〔1〕。本文闡述ERS發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)、ERS在心肌缺血再灌注損傷中的作用、針對ERS防治心肌損傷的研究進(jìn)展。

1 ERS發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

1.1基因活化 ER跨膜蛋白激酶(IRE)-1具有內(nèi)切酶活性，應(yīng)激時，通過自身核酸內(nèi)切酶，選擇性剪切X盒結(jié)合蛋白(XBP)-1的mRNA，去除26 bp內(nèi)含子序列從而進(jìn)一步使蛋白翻譯移碼并產(chǎn)生XBP-1蛋白，并由此轉(zhuǎn)錄并活化ERS反應(yīng)元件(ERSE)基因。

轉(zhuǎn)錄激活因子(ATF)-4在未應(yīng)激時可以干擾轉(zhuǎn)錄本上游5′非翻譯端短暫開放性閱讀框，從而使起始密碼子不能有效識別，不能有效翻譯。但在應(yīng)激時，短暫開放閱讀框不能利用，ATF-4蛋白顯著升高，其表達(dá)產(chǎn)物在核內(nèi)聚集促使葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白前體78(GRP78)/免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(Bip)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)/生長抑制和DNA損傷誘導(dǎo)基因(GADD)153、XBP-1、GADD34等部分基因表達(dá)。

ATF-6在ERS后從ER轉(zhuǎn)移到高爾基體，特異蛋白酶S1P和S2P從膜上水解其反式激活結(jié)構(gòu)域，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中與ERSE作用，激活較多ERS反應(yīng)蛋白的轉(zhuǎn)錄，如：GRP78/Bip、CHOP/GADD153、XBP-1等。特異水解酶同時可以識別并裂解激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBPs)，增加細(xì)胞脂質(zhì)合成。

1.2早期蛋白質(zhì)生物合成暫緩 蛋白質(zhì)在ER上核糖體合成輸出之前，必須進(jìn)行正確的折疊包裝。ER蛋白質(zhì)折疊需要在氧化還原條件下進(jìn)行，需要兩種ERS反應(yīng)蛋白，分別是ERS氧化還原酶(ERO)1和二硫化蛋白水解酶。一般情況下，真核細(xì)胞中分別由ER跨膜蛋白肌醇酶(IRE)-1、ATF-6、蛋白激酶R樣ER激酶(PERK)這三種感應(yīng)蛋白介導(dǎo)蛋白質(zhì)的不正確折疊。當(dāng)應(yīng)激反應(yīng)時，這三種蛋白與GPR78/Bip分離并自身激活，引起蛋白質(zhì)折疊錯誤，進(jìn)而引起ERS。這種蛋白質(zhì)折疊錯誤引起的ERS反應(yīng)稱為“未折疊蛋白反應(yīng)”(UPR)。心肌細(xì)胞特異的ER蛋白增強(qiáng)PERK的表達(dá)及磷酸化，增加ATFCHOP表達(dá)，對ERS起到心肌保護(hù)作用〔2〕。PERK自我磷酸化激活劑自我聚集將磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子2α的色氨酸(Ser)51磷酸化，阻止與GTP結(jié)合，使起始蛋氨酸-RNA與核糖體結(jié)合無法進(jìn)行初始翻譯，阻斷新生蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸，避免ER超負(fù)荷。

1.3ER內(nèi)錯誤蛋白降解 ER是真核細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)量鑒別、控制和校正裝置，保證合格蛋白的輸出，不能正確折疊的蛋白質(zhì)可以通過此系統(tǒng)從ER逆轉(zhuǎn)至細(xì)胞質(zhì)并被26 S蛋白酶體降解〔3〕。

1.4ER性細(xì)胞凋亡的發(fā)生 ERS后，通過一系列信號傳導(dǎo)通路，引起細(xì)胞凋亡，稱為ER相關(guān)性死亡(ERAD)。這一過程，由多種蛋白、蛋白水解酶及基因參與。

CHOP基因的啟動子上含有氨基酸應(yīng)答元件(AARE)，AARE或相關(guān)元件可以調(diào)節(jié)CHOP蛋白表達(dá)ERS或氨基酸剝奪〔4，5〕。CHOP蛋白或與C/EBP或Iun/Fos家族蛋白形成雜二聚體，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游相關(guān)凋亡基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證明，如果在細(xì)胞中加入可使Ca2+從ER轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中的毒胡蘿卜內(nèi)酯(TG)后，隨著試劑的作用時間延長，CHOP大量表達(dá)可進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞生長停止、死亡；但如果刪除CHOP蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的轉(zhuǎn)基因后，細(xì)胞加入這種試劑后細(xì)胞凋亡可以明顯減弱，進(jìn)一步表明CHOP介導(dǎo)了TG導(dǎo)致ERS時的細(xì)胞凋亡〔6〕。

c-Jun氨基末端激酶(JNK)家族是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的一員〔7〕，可介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生〔8〕，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。JNK對轉(zhuǎn)錄因子氨基末端進(jìn)行磷酸化修飾、激活轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)節(jié)下游相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄和凋亡蛋白的表達(dá)〔9〕，是ERS后細(xì)胞凋亡的重要中間信號分子。活化的JNK進(jìn)入細(xì)胞核，激活相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子后，還可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡介導(dǎo)因子(Bim)、BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(Bid)等BH3結(jié)構(gòu)域(BH3-only)蛋白的表達(dá)，從而活化Bax等促凋亡蛋白。這種活化途徑原本認(rèn)為只存在于線粒體，但目前研究表明同樣存在于ER，但途徑略有不同，需要ER特有Caspase-12和Ca2+參與，也提示ER與線粒體引起細(xì)胞凋亡存在不同信號傳導(dǎo)途徑〔10〕。近些年發(fā)現(xiàn)一種Gipie蛋白，隸屬于輔伴侶分子Girdin家族，可穩(wěn)固GRP78與IRE1的結(jié)合并減弱IRE1誘導(dǎo)的JNK激活途徑，從而抑制細(xì)胞凋亡〔11〕。

ER性細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者是含有水解酶功能的Caspase蛋白水解酶，特征性Caspase-12僅存在于ER。ERS時與Caspase-12結(jié)合的伴侶蛋白Bip減少，Caspase-12暴露活化后可引起細(xì)胞凋亡〔12〕。

2 ERS在心肌缺血再灌注損傷中的作用

2.1Ca2+失衡引起了ERS 心肌收縮依靠心肌細(xì)胞的興奮收縮耦聯(lián)，Ca2+的內(nèi)外平衡是關(guān)鍵。同樣，在心肌細(xì)胞中有豐富的ER，亦稱之為肌漿網(wǎng)，當(dāng)肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+清空時細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+超載，ER中鈣穩(wěn)態(tài)失衡可誘發(fā)過度ERS〔13〕。創(chuàng)傷、失血、再灌注等多種因素引起的心肌細(xì)胞損傷均與蛋白質(zhì)折疊有關(guān)，Ca2+超載是其主要機(jī)制，因此，鈣超載致ERS在心肌損傷中起著重要的作用。心肌缺血后再灌注過程中，Na+-Ca2+交換和L型鈣通道被阻斷，Ca2+敏感受體表達(dá)增多，1,4,5-三磷酸肌醇受體(IP3R)蛋白表達(dá)增多，釋放Ca2+，直接引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，誘發(fā)ERS〔14〕。同時有研究發(fā)現(xiàn)，ER特異性凋亡蛋白Caspase-12活化片段表達(dá)增多，這進(jìn)一步詮釋了ERS在心肌損傷中的作用〔15〕。

2.2ERS相關(guān)蛋白過表達(dá)引起了ERS 在乳鼠缺氧復(fù)氧心肌缺血再灌注模型上，發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧心肌活力減低，胞內(nèi)乳酸脫氫酶漏出，心肌細(xì)胞ERS蛋白GRP78表達(dá)增加，持續(xù)24 h。表明缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)GRP78表達(dá)增加，引起心肌細(xì)胞ERS〔16〕。Petrovski等〔17〕應(yīng)用不同劑量的衣霉素或TG誘導(dǎo)心肌溶解的模型，發(fā)現(xiàn)衣霉素或TG均引起了心肌細(xì)胞ERS，eIF2α和PERK活化增強(qiáng)，CHOP表達(dá)增多，引起了心肌細(xì)胞的自噬現(xiàn)象；最為關(guān)鍵的是，小劑量的衣霉素或TG提高了左心室功能、減少了心肌梗死面積與細(xì)胞凋亡；相反，大劑量的衣霉素或TG增加了心肌細(xì)胞損傷。

同時發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注中低氧引起的ERS導(dǎo)致的基因表達(dá)重塑，可影響心肌細(xì)胞的存活〔18〕。與缺氧密切相關(guān)的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1α，在輕度低氧時活性無明顯變化；但內(nèi)源性HIF1α誘導(dǎo)基因抑制因子增多，通過ATF6通路GRP78基因誘導(dǎo)ERSE轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)缺血性損傷。心肌缺血過程中，ERS被激活，但再灌注時為非激活狀態(tài)。通過RNA干擾技術(shù)或基因敲除技術(shù)阻斷ATF6后GRP78表達(dá)明顯降低，心肌細(xì)胞凋亡增加〔19〕，提示ATF6在缺血再灌注過程中起到存在類似預(yù)處理保護(hù)作用，說明在ERS中被調(diào)整的部分基因在心肌缺血時編碼的蛋白對心肌具有保護(hù)作用。

Ngoh等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)0位N-乙酰葡萄糖胺(0-GlcNAc)修飾可以減少ERS誘發(fā)的心肌細(xì)胞死亡。心肌受損擴(kuò)張時，ER膨脹，CHOP/GADD153表達(dá)增加，能夠易化ER單板的靶向運(yùn)轉(zhuǎn)的賴-天冬-谷亮氨酰四肽序列(KDEL)受體突變并引起細(xì)胞凋亡增加〔21〕。熱休克蛋白(HSP)72通過物理干擾，加強(qiáng)IRE1a-XBP1信號可以保護(hù)細(xì)胞免受ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡〔22〕。

可見，過度表達(dá)的ERS相關(guān)蛋白在引起ERS的同時，加重了心肌細(xì)胞損傷。

3 以ERS為切入點(diǎn)，防治心肌損傷的研究

在衣霉素誘導(dǎo)ER反應(yīng)的心肌細(xì)胞和離體心肌缺血再灌注損傷心臟中，加入蛋白激酶Cδ抑制劑可降低其誘導(dǎo)標(biāo)志物CHOP及GRP78、磷酸化JNK蛋白水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，對心臟具有保護(hù)作用〔23〕。加入脯氨酰羥化酶抑制劑酶可以誘導(dǎo)缺血再灌注心肌的ATF4、GRP78和A甘露糖苷酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解增強(qiáng)蛋白表達(dá)，有效減少CHOP表達(dá)從而起到減輕缺血后心肌損傷〔24〕。同樣，增加活化ATP6或藥物激活磷酸腺苷激活蛋白酶(AMPK)可以減少缺血再灌注后的心肌損傷，增強(qiáng)心室功能、減輕心肌細(xì)胞耗氧〔25，26〕。

祝筱梅等〔27〕建立缺氧/復(fù)氧模型，低氧預(yù)處理誘導(dǎo)p38 MAPK磷酸化水平升高，低氧預(yù)處理前應(yīng)用p38 MAPK特異性抑制劑可消除低氧預(yù)處理誘導(dǎo)的鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)上調(diào)，并明顯削弱低氧預(yù)處理抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的Caspase-12活化的作用，這對穩(wěn)定細(xì)胞功能減緩應(yīng)激狀態(tài)及減輕ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有著重要作用。另外，研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注初短暫低pH液復(fù)灌可抑制過度ERS，減輕ER凋亡信號介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生保護(hù)心肌〔28〕。此外，有研究發(fā)現(xiàn)牛磺酸可明顯降低燒傷大鼠的GRP94的表達(dá)和Caspase-3活性，降低心肌細(xì)胞ERS，從而減輕燒傷引起的心肌損傷〔29〕。前期研究表明，腸淋巴管結(jié)扎減少腸淋巴液回流可減少二次打擊大鼠心肌細(xì)胞，降低細(xì)胞損傷〔30〕，但其機(jī)制是否與抑制心肌細(xì)胞ERS有關(guān)，還有待進(jìn)一步觀察。

可見，掌握心肌細(xì)胞損傷時ERS反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制，對于心肌損傷的防治具有較大的指導(dǎo)意義。但大多數(shù)研究還處于動物實(shí)驗(yàn)階段，應(yīng)進(jìn)一步開展相關(guān)的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究，盡早應(yīng)用到臨床患者心肌損傷的防治。

4 小結(jié)與展望

ERS反應(yīng)是一種多信號通路、多基因表達(dá)并由多種應(yīng)激因素參與的過程。在輕度或早期心肌損傷時，ERS反應(yīng)有多種保護(hù)分子蛋白參與，對于細(xì)胞抵抗病理應(yīng)激有積極的保護(hù)作用。過長時間或過度的ERS，多種應(yīng)激反應(yīng)的共同通路，導(dǎo)致基因過表達(dá)、蛋白質(zhì)折疊等，可引起細(xì)胞功能紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞溶解、凋亡、壞死，參與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。目前對于ERS與心血管疾病的研究逐漸深入；但是參與ERS的因素很多。通過細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、病理生理學(xué)以及臨床醫(yī)學(xué)的深入研究，最終會全面透徹地認(rèn)識ERS反應(yīng)的機(jī)制，并進(jìn)一步應(yīng)用于心肌損傷的防治。

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