腦卒中大鼠神經功能修復的行為學評估方法

周佳麗，祝慧鳳，萬 東，李曼霞，何 坪，徐曉玉

大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型已成為研究腦卒中的理想模型，通過此模型所產生的病理學及癥狀學改變接近臨床腦卒中患者[1]。該模型主要有兩種形式：永久性近側大腦中動脈閉塞(pMCAO)模型和永久性遠側大腦中動脈閉塞聯合兩側頸總動脈90 min閉塞(dMCAO/tMCAO)模型。在大鼠腦卒中研究中，pMCAO模型使用頻率較高，采用的方法即所謂的“Tamura”法和改良的“Tamura”法[2-3]。該模型可在大鼠背外側大腦皮質及其下層的紋狀體產生相當的梗死面積，此皮質區域與對側前肢和后肢功能有關，可控制對側肢體感覺運動行為，而且動物存活時間較長，越有利于腦卒中的恢復研究。盡管有部分研究者對dMCAO/tMCAO這種混合式的缺血變異做過研究，但總的來說對此模型的研究都不是很深入[4-7]，其產生的梗死灶限于額部和頂骨部的新大腦皮質。

大鼠MCAO模型的相關病理生理學已有較為詳細的研究和描述[8-9]，其最大的局限在于缺乏一系列持久的、穩定的、適當的評估方法來檢測動物大腦局灶性缺血后行為障礙的改善及其對應神經功能的恢復，這就對腦卒中恢復藥的藥效研究造成了一定困難。雖然病理檢測與腦梗死體積的測量也可以成為腦卒中恢復藥藥效評價的重要手段，但動物行為學的改變與檢測在藥效研究中是絕對不容忽視的。檢測腦卒中恢復藥的最佳動物模型應包括一定程度的但不是完全性的恢復，這可能更接近人腦卒中的實際狀況。有研究表明，在嚙齒類動物模型中腦卒中后的第1周就有一定程度的神經自我修復，一部分正常和接近正常的腦組織同時也會表現出一定的異常功能[10-11]，神經修復程度與鼠齡也密切相關，這就顯示單純依靠病理檢測或腦梗死體積的測量來評估藥效有一定缺陷。腦卒中模型大鼠的對側前肢和后肢功能會出現明顯的障礙，并且這種功能障礙在1個月左右后出現緩慢、穩定、不完全的恢復，因此在組織學檢測之外采用恰當的行為學檢測是必要的。

行為學評估分為感覺運動行為評估和認知行為評估：感覺運動行為評估主要偏向于對大鼠視覺、觸覺、胡須和本體感受刺激的反應以及肢體運動功能方面的評價；認知行為評估主要偏向于大鼠學習記憶能力方面的評價，如被動回避(passive avoidance)[12]、旋臂迷宮(radial arm maze)[13]、Morris 水迷宮(morris water maze)[14]等。現將國外學者制訂的一些感覺運動行為評估方法綜述如下。

1 單一性神經行為檢測

1.1 神經癥狀評分類

1.1.1 姿勢反射檢測 抓住大鼠尾巴，高于桌面10 cm，使其保持較為穩定狀態。正常大鼠兩個前爪伸向桌面，而MCAO右側結扎的大鼠，左前爪屈曲。記分標準如下：1分，前肢屈曲，無其他異常；2分，向癱瘓側推鼠，阻力減小；3分，鼠自由活動時，向患側打圈[15]。

1.1.2 Berderson評分法[2]輕抓尾巴，提起大鼠高于桌面10 cm，正常大鼠前爪伸直。0分：無神經功能缺損；1分：腦部病變對側腕關節、肘關節屈曲，肩內收屈曲；2分：上述體征+向麻痹側推阻力下降；3分：活動時向麻痹側打圈(呈追尾狀)。

1.1.3 Longa神經病學評分法[16]0分：沒有神經功能缺損；1分：左側前爪不能完全伸展；2分：行走時，大鼠向左側轉圈；3分：行走時，大鼠身體向左側(癱瘓側)傾倒；4分：不能自發行走，有意識喪失。

1.2 肢體對稱平衡類

1.2.1 升高肢體擺動測試(elevated body swing test，EBST) EBST通常用于不對稱的運動行為的測試。將大鼠尾部提起，使其升高到離試驗臺2.5 cm的位置。大鼠第1次肢體擺動的方向只要被確定為是上身的擺動并且不管朝哪一邊，擺動角度大于10°，均被記錄下，測試完畢1次放置大鼠于實驗臺上，接著又重新提高進行測試，每只大鼠給予5 min時間。記錄向左或向右轉動的次數以及相關百分比反映了大鼠上身肢體擺動的偏好。實驗中正常大鼠無典型的朝向偏好，然而單側腦卒中大鼠則明顯表現出向大腦病變對側偏轉的強烈趨向。計算每周測試的平均分作為分析記錄。模型大鼠表現出強烈的偏轉傾向，即偏向患側對側，1周測試的平均分作為最后記錄[17]。

1.2.2 平衡木評分法 平衡木反映的是前庭功能及本體感覺的變化，具備一定技巧性。造模前，需要進行為期1周的平衡木練習，讓大鼠快速地通過升高的平衡木，進入較暗的飼養箱，并且做好終點線(finish line)的標志。平衡木為長80.0 cm、寬2.5 cm、高2.5 cm的方木棒，行走面相對光滑。升高平衡木到距離地面1 m處，下方固定，用泡沫做鋪墊，防止大鼠行走時跌下。每次測試時大鼠連續3次通過平衡木，記錄通過平衡木的潛伏期以及通過時大鼠前肢或后肢踩空(foot faults)的次數。除此之外，若用評分標準則分為6個等級：0分，能跳上平衡木，在上面行走不會跌倒；1分，能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會少于50%；2分：能跳上平衡木，在上面行走跌倒機會大于或等于50%；3分，在健側后肢的幫助下能跳上平衡木，但受累癱瘓側后肢不能幫助向前移動；4分，在平衡木上不能行走，但可以坐在上面；5分，將大鼠放在平衡木上會掉下來。正常大鼠一般能在平衡木上平穩地通過，而模型大鼠通常前肢或后肢踩空，甚至從平衡木上滑落下來。3次測試結果的平均分作為最后成績[18]。測試時間為術后治療前7 d或15 d時以及治療后4周或9周時。

1.2.3 肢體對稱測試 將大鼠放于一定規則的鐵絲網中，網眼大小為2.3 cm×2.3 cm。當大鼠在網中行走時，計數2 min內其前爪漏到網眼中的次數。計數公式：(腦病變對側前爪的錯步數-腦病變同側前爪的錯步數)/總步數；分值為正表明腦病變對側功能缺損；分值為負表明腦病變同側功能缺損[19]。

1.3 肢體運動能力類 肌力檢測：將一直徑為0.15 cm、長46 cm的鐵絲繩置于距地面70 cm處，其下放3.5 cm泡沫箱。將鼠前爪放在繩上，放開，記錄大鼠在繩上的時間。0分：掛于繩上0～2 s；1分：3～4 s；2分：5 s；3分：5 s后大鼠將后腿放在繩上[20]。

2 復合性神經行為檢測

2.1 感覺運動整合類 感覺運動整合是指透過視、聽、嗅、味、觸、重力感等感覺器官接受外界環境的訊息(刺激)，經由感覺神經傳達到大腦、脊髓等中樞神經。經由大腦整理、組織后，透過運動神經做出對外界訊息的一種反映。而經由各種訊息的刺激，大腦加以整理、儲存、技藝、學習，完成整個神經系統的連接與健全，奠定大腦組織架構的完成，這個過程就叫感覺整合。訓練和測試方式通常有圓筒測試(cylinder test)、安置測試(placing test)等，反映感覺功能、本體感功能、空間知覺功能等。

2.1.1 圓筒測試 本實驗是Schallert等[21]設計研制的，將大鼠放于一個透明的聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃圓筒內，圓筒直徑為18 cm、高30 cm，同時用攝像機記錄大鼠在其中的活動情況，時間為3～5 min，分析大鼠使用前肢的偏喜情況及不對稱或偏位狀態。該圓筒對大鼠來說有足夠的活動空間，同時又促使其對側壁進行探視，并使其無法爬到圓筒的頂部。在圓筒的背后直立一面鏡子，便于當大鼠背對攝像機時實驗員記錄其前肢活動的狀況。在觀察過程中，大鼠使用一側前肢或雙側前肢豎立觸壁(vertical exploration of the walls)及觸底(landing)的數量均被記錄。當大鼠在圓筒中探視時，第1次將某一前肢放置在側壁上時，該行為被記錄為“independent wall movement”1次，接下來如果大鼠又將另一側前肢放置在側壁上，而先前的那側前肢又沒有放下或移開，該行為被記錄為“simultaneous limb-use movement”1次。依次按照此類方法記錄前肢情況。在大鼠偶然對側壁探視完后，第1次將某一前肢放置圓筒底部時，該行為被記錄為“landing”1次，如果兩前肢同時接觸底部，該行為被記錄為“simultaneous limb-use”1次。不確定和判斷困難的動作不納入記錄范圍。

最后將記錄的次數進行統計分析：(1)使用非受損前肢的活動次數與活動次數的總數作比較；(2)使用受損前肢的活動次數與活動次數的總數作比較。使用非受損前肢的百分比數減去使用受損前肢的百分比數得出全部前肢偏喜程度。前肢觸壁及觸底的情況再分別獨立分析。1周測試1次，每次讓大鼠探視2次，2次的得分計算平均分作為最后統計結果。測試時間為術后7、14、21、28 d。

2.1.2 安置測試 該實驗是由De Ryck等[22]設計的，該實驗中能反映與視覺、胡須觸覺、本體觸覺以及本體感受刺激相對應的獨立的前肢安置狀態。同時與肢體觸覺和本體感受刺激相對應的后肢安置狀態也同樣在該測試中得到反映。檢查前肢安置狀態時，將大鼠的軀干升高一定高度，保持前爪自由懸空，然后慢慢移向桌面邊緣，讓其觸須與桌面邊緣做短暫接觸(一種是視覺誘導的安置，另一種是觸須感應誘導的安置)，同時將前爪與桌面邊緣做輕微的接觸(這是由肢體觸覺誘導的安置)，接著保持這一狀態，在前肢上不斷施加壓力(這是由本體感受誘導的安置)。用同樣的方法測試后肢安置狀態(由肢體觸覺和本體感受誘導的安置)。在前后肢的每只爪上重復測試6次，不管哪一只爪，直到出現3次正確的安置即可。每次測試記錄完全安置的3次，1周計算得分，平均值作為統計分析記錄。

2.2 細微運動協調類 細微運動協調指先對實物或圖解的細微部分具備正確的知覺感受能力和比較辨別能力，然后能正確而迅速地使眼和觸覺或嗅覺與肢體運動相協調，并迅速完成操作的能力。

2.2.1 單個小丸作業(single pellet task) 測量模具的制作采用透明的聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃箱，尺寸為45 cm×14 cm×35 cm。在玻璃箱正前面的中央有一1 cm寬的縫隙條，從離地面2 cm處升高到離地面15 cm處。在容器外側即裂縫前端，裝上一離地面3 cm高、2 cm寬的橫條架，然后在1 cm寬的縫隙條兩側各向外延伸1 cm處分別作一條劃痕，小丸最開始置于這兩條劃痕處的橫條架上，一旦大鼠在抓取時表現出了某一前肢偏喜后，小丸就放于偏喜前肢的對側。每次放置小丸時，有較短時間的間隔，這將刺激大鼠每次抓取后返回容器中探視，之后重新調整姿勢準備下次的抓取。每天訓練1次，每次給予10 min的抓取時間，連續抓取20粒小丸作為完全成功的記錄，抓取成功率的計算方法為：成功率=(每次抓取的數量/20)×100，最后結果做統計比較[23-24]。

2.2.2 托盤作業(tray task) 測試模具為一長26 cm、寬19 cm、高28 cm的鐵籠。容器的正前面由寬2 mm的豎欄桿支撐并且兩欄桿之間有9 mm寬的縫隙。頂部由透明的聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃構成，便于觀察。在正前面欄桿的前面裝有一寬4.0 cm、深0.5 cm的托盤，在鐵籠的后部有供水處。每次裝30 mg食物，大鼠能自由從欄桿空隙中伸肢抓取食物并獲得食物，每天堅持1 h的訓練，連續7 d。測試時每只大鼠給予10 min的時間，評估方式：如果前肢伸過欄桿空隙，但是未抓到食物或食物滑落，被計為“reach”；如果獲得食物并且吃掉計為“hit”，用下列公式計算：Percent success=(number of hits/number of reaches)×100，最后進行統計分析。在訓練和測試時，保證大鼠處于空腹狀態，且連續下來體質量不能減輕到原體質量的85%[23，25]。測試時間為術后1、3、7、15 d，或治療后4周甚至9周。

2.2.3 樓梯抓取技能測試(staircase skilled-reaching test) 在階梯測試和訓練期間，大鼠的食物要限制在12 g/d，每天記錄體質量，體質量不能下降到原始體質量的80%。在造模前2周開始訓練，每次訓練時間為2～15 min，讓大鼠抓取階梯上的小丸。測量模具由7步臺階組成，每步臺階上放有3粒小丸。staircase裝置固定于大鼠的任意一邊，要求大鼠必須爬上臺階的中心平臺去獲取食物。以大鼠每邊獲取小丸的數量用來作為前肢抓取能力的測量。在手術造模后，治療的前1周進行測試，連續5 d，每天測試2次，每次記錄每只大鼠的抓取量，然后進行統計分析比較[26-27]。

綜上所述，一系列有關神經功能修復的行為學評定體系正在逐步成熟。這些測試以不同的程度和形式追蹤實驗性大鼠腦卒中后各種類型的行為改變，對治療因素的效果評估具有相對足夠的敏感性。將行為測試與組織病理觀測、腦梗死體積測定這兩者緊密地、分區域地聯系起來，使形態學的論證依據變得飽滿，讓治療因素的優勢具有充分的說服力，也利于實驗者的分析比較。這些行為測試不是獨立的，若能有效、合理地將之進行聯合搭配，這將對腦卒中模型動物的感覺運動行為評估開辟更為寬闊的前景。

目前仍存在一些問題值得探索。一方面在選擇上：(1)國內外文獻對實驗性腦卒中的研究在急性期與慢性期的時間分隔上未能有較深入的闡述；國內部分相關實驗大多基于大鼠腦卒中急性期即相對較短期限的研究，常忽視了慢性期這一療效評估的重要時期。這也造成了實驗與臨床脫軌的尷尬局面，即人體給藥時間和劑量難以從大鼠模型上進行外延與擴展；(2)由于對前述的急性期與慢性期的問題未進行深入研究，使得部分實驗研究在較長時間治療后仍然采用較為單一的簡單神經反射評分進行行為學評分，因存在自我修復及正常部分代償的問題，即在7 d左右，腦卒中大鼠的某些神經癥狀就已經自我恢復正常了，所以用前述方法極為不科學，并且結果常產生一定的誤導作用。什么時期采用何種評價方式是亟須解決的問題。另一方面，在操作上，上述一系列感覺運動評估方式皆具有一定的主觀性和對實驗者的依賴性，其結果的重復性相對較為困難，對動物的飲食、活潑度、實驗員的主觀能動性均有一定要求。因此，如何更客觀、更量化、更有可操作性及重復性，也有待解決。

總之，合理選擇與客觀操作，獨立、重復、盲法及隨機的原則都是在實驗中需堅持的。隨著現代生物科學技術的發展，行為學檢測模具及相關機制的研究將被進一步深入與創新，行為學發展的藍圖也更加令人期待。

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