骨髓基質干細胞移植治療腦和脊髓損傷的研究進展

和鳳軍 陳 普 陳學秋 唐柱生

云南中醫學院，云南 昆明 650500

骨髓基質干細胞 (bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)又稱為骨髓間充質干細胞 (MSCs)，因該細胞具有多向分化潛能，取材、培養簡便，組織相容性好，易于基因操作等特點，在一定的環境或特定誘導劑的誘導下可以分化為神經元和神經膠質細胞，已廣泛應用于腦和脊髓損傷的實驗研究和臨床應用研究。綜述如下。

1 骨髓基質干細胞移植治療腦和脊髓損傷實驗研究

1.1 骨髓基質干細胞移植治療腦損傷的實驗研究 1999年Kopen等［1］將骨髓基質干細胞 (BMSCs)注射到新生小鼠側腦室，發現海馬、嗅球和紋狀體等部位均有BMSCs來源的神經組織細胞。2000年BrazeIton［2］等將成年小鼠轉綠色熒光蛋白 (GFP)的BMSCs經尾靜脈移植至致死量照射的同基因小鼠，發現在嗅球、海馬、皮質和小腦等部位有GFP陽性細胞。Mezey等［3］經小鼠腹腔移植BMSCs，發現在腦分化成表達神經元特異抗原的神經細胞。Sancher Ramos等［4］在 DMEM 培 養 液 中 加 入 FGF10ng/ml或PDGF10ng/ml培養人BMSCs，結果有0.2% ～5%的細胞分化成為不成熟的神經元和膠質細胞。Park等［5］將轉入膠質細胞來源的神經營養因子 (GDNF)的BMSCs移植到帕金森病模型鼠，發現轉基因BMSCs對黑質細胞有保護作用。Li等［6］阻塞大鼠大腦中動脈，在紋狀體局部注射和靜脈移植骨髓非造血細胞，28d后發現移植的BMSCs在缺血腦內成活并向缺血區遷移了大約2.2mm，缺血鼠的運動功能改善明顯。可能機制為:BMSCs通過細胞替代由疾病或損傷引起的神經功能缺損，同時，分泌多種細胞因子，如IL－7，IL－8，IL－11等及神經營養因子等，有助于缺血腦組織的修復［6］。Chen等［7］阻塞大鼠大腦中動脈 (MCAO)后，靜脈移植BMSCs，接受大劑量 (3×106)移植的大鼠運動、本體感覺和平衡能力在移植后14d改善明顯，BMSCs在缺血半球的成活積聚，分化細胞表達神經元標志蛋白。經頸總動脈移植BMSCs治療卒中大鼠也有類似結果［8］。Li等［9］將MCAO大鼠經尾靜脈移植人BMSCs，觀察到人BMSCs并沒有使受體大鼠產生細胞毒性T淋巴細胞反應。由mAb1281標記的hMSC中有1%表達NeuN，1%表達MAP 2.5%表達GFAP、2%表達vWF，組織學觀察發現缺血邊緣區凋亡細胞數量減少、VZ/SVZBrdu陽性細胞增加顯著，腦源性神經營養因子 (BDNF)和神經生長因子 (NGF)分泌增加 (P＜0.05)。

BMSCs作用機制尚未完全清楚。可能機制有:BMSCs及其分化的神經膠質細胞含有促進神經再生的細胞因子和受體，促進神經組織修復，抑制瘢痕形成，參與神經環路整合等［10］。現已證明骨髓基質細胞 (MSCs)可以分化成多種神經細胞，腦內直接移植、腦脊液移植或血管內移植均能促進腦損傷修復。BMSCs可能替代受損細胞［11］。BMSCs在體內或體外都可分化為神經細胞，BMSCs向神經細胞分化可能與cAMP的增加激活 PKA和 MEK－ERK信號通路［12］。

1.2 骨髓基質干細胞移植治療脊髓損傷的實驗研究

Chopp［13］等在大鼠脊髓T9節段損傷模型，1周后在損傷中心局部移植BMSCs，用Basso－Bettle－Breseehan(BBB)評分評價神經功能。所有大鼠的神經功能缺損癥狀隨時間的推移而減輕，且移植組明顯好于對照組。BMSCs表達了神經元和少突膠質細胞蛋白標記物。Hofstetter等［14］移植BMSCs治療大鼠脊髓挫傷，BMSCs與非成熟星形細胞 (損傷后來源于干細胞)緊密整合;在移植物與瘢痕組織交界處，發現NF、5－HT陽性纖維;BMSCs表達纖維蛋白連接素(fibronectin)和NeuN免疫活性;BMSCs可能引導再生的神經纖維通過損傷區。李雷等［15］取2～4個月Wistar大鼠的股骨和脛骨骨髓腔內骨髓基質細胞，將BMSCs細胞混懸液移植到脊髓半切損傷頭側和尾側灰白質交界處，移植后1d、3d和7d，用RT－PCR檢測GDNF(gliocyte derived neurotrophic factor，GDNF)mRNA，正常大鼠脊髓表達極低，脊髓損傷后1d明顯升高，3d達高峰，隨后開始下降，7d表達仍高于正常水平。且移植組不同時間點GDNFmRNA表達均高于對照組。美國明尼蘇達大學的研究者［17］將從骨髓細胞中分離出來的干細胞移植到小鼠胚囊，發現這些干細胞可以分化為神經細胞、神經膠質細胞、髓磷脂形成細胞等。

骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷的可能機理:骨髓間充質干細胞可填補損傷部位，定向分化為神經細胞完成上行下傳功能的重建，創造抑制膠質細胞再生、保護神經元存活。骨髓間充質干細胞 (mesenchymal stem cells，MSCs)在體內分化為神經干細胞后，神經干細胞的誘導分化可能有以下四條途徑:①富含細胞因子的特殊培養基誘導分化;②基因調控;③信號轉導;④改變細胞表面特性［18］。脊髓損傷后自身神經細胞分化再生極少，移植神經干細胞和自體的神經干細胞都可分泌多種促神經修復細胞因子［19］。移植的最佳時間在脊髓損傷后第9天前后，此時局部的微環境比較適合移植細胞的生長和分化［20］。

2 外源基因導入骨髓基質干細胞實驗研究現狀

1998年Cherington等將逆轉錄病毒作為人FIX載體，把FIX基因轉入骨髓MSC，帶有人FIX基因的狗骨髓MSC回輸，發現FIX血漿水平是健康者的2.1% ～5.8%。2002年Liu［21］等構建了FLT3(FL)逆轉錄病毒載體，轉入MSC中表達。通過質粒、逆轉錄病毒、腺病毒等載體可將外源基因導入骨髓MSC并得以表達。

3 骨髓基質干細胞移植治療中樞神經損傷的臨床應用研究

步星耀等［17］應用BMSCs移植治療87例脊髓損傷的臨床研究發現:BMSCs移植治療安全顯效;移植方法－BMSCs脊髓內移植與BMSCs椎管內移植相結合;移植途徑有:①受損脊髓處多靶點注射;②擴增的BMSCs移植于蛛網膜下腔;③開放血腦屏障，將擴增的BMSCs靜脈輸入。臨床顯效的機理可能為:①單核巨噬細胞侵入損傷部位吞噬壞死組織;②促進局部新生血管生成和血管重建，改善神經營養;③神經再生，包括促進自體神經細胞再生和移植細胞分化為神經細胞兩個方面。

BMSCs已應用于臨床上治療脊髓損傷等中樞神經系統疾病和骨關節疾病［22］。代喜平等［23］以腰椎穿刺方式分別行骨髓MSCs或臍血MSCs蛛網膜下腔移植治療23例脊髓損傷患者，移植前與移植后3個月進行美國脊髓損傷學會損傷分級評分，均取得滿意的療效。

4 存在的問題及展望

目前，BMSCs移植治療腦和脊髓損傷和疾病的研究存在以下問題:①BMSCs移植治療機理和信號傳導通路的研究不夠;②BMSCs誘導分化成神經細胞后缺乏特異性的細胞標志，目前尚無有效的檢測方法;③移植的BMSCs能否和受體的神經組織整合、重建突觸、與靶器官建立功能性聯系等尚未完全清楚。④BMSCs移植治療遠期安全性評價、致瘤率尚無確切證據。

總之，移植BMSCs治療腦和脊髓損傷的研究應加強信號傳導通路、機理、特異性檢測BMSCs分化為神經元的方法等，隨著研究的深入，BMSCs將為治療腦和脊髓損傷帶來光明的前景。

［1］ Kopen G C，Prockop D J，Phinney D G．Marriow stromal dells migrate throughout fore brain and cerebelium，and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1999，96:10711－10716．

［2］ BrazeIton T R，Rossi F M ，Keshet G L，et al．From marrow to brain:expression of neuronal phenotypes in adult mice［J］．Science，2000，290:1775－1779．

［3］ Mezey E，Chandross K J，Harata G，et al．Turing blood in to brain:cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow ［J］．Science，2000，290:1779－1782．

［4］ Sancher－Ramos J，Song S，Cardozo－Pelaez F，et al．Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro［J］．Exp Neurol，2000，164:247－256．

［5］ Park K W，Eglitis M A，Mouradian M M．Protection of nigralneurous by GDNF － engineered marrow cells transplantation［J］．Neurosci Res，2001，40(4):315－323．

［6］ Li Y，Chopp M，Chen J，et al．Intrastriatal transplantation of bone marrow nonhematopietic cells improves functional recovery after stroke in adult mice［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2000，20(9):1311－1319．

［7］ Chen J，Li Y，Wang L，et al．Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats ［J］．Stroke，2001，32:1005－1011．

［8］ Li Y，Chen J，Wang L，et al．Treatment of strike in rat with intracarotid administration of marrow stronmal cells［J］．Neurology，2001，56:1666 －1672．

［9］ Li Y，Chen J，Chen X G，et al．Human marrow stromal cell therapy for strokein rat:neutrotrophins and functional recovery［J］．Neutrology，2002，59:514－523．

［10］趙宗茂，張慶俊，韓忠朝等．骨髓基質干細胞移植對大鼠脊髓損傷神經功能恢復的影響［J］．中華神經外科雜志，2003，19(1):58－61．

［12］劉文鵬 (綜述)，徐如祥 (審校)．骨髓基質細胞移植治療腦損傷研究進展［J］．中華神經醫學雜志，2004，3(5):394－397．

［13］ Jori F P，Napolitano M A，Melone M AB，et al．Moleculer Pathways involved in neural in vitro differentiation of marrow stromal stem cells［J］．J Cell Bio chem，2005，94:645－655．

［14］Chopp M，Zhang XH，Li Y，et al．Rosenblum M．Spinal cord injury in rat:Treatment with bone marrow stromal cells transplantation．Neuroreport 2000，11:3001－3005．

［15］ Hofstetter CP，Schwarz EJ，Hess D，et al．Marrow stromal cells form guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery［J］．Proc Natl AcadSci USA，2002，99(4):2199－2204．

［16］李雷，呂剛，王巖峰等．骨髓基質細胞移植對大鼠損傷脊髓GDNFmRNA表達的影響［J］．中國醫科大學學報，2005，34(2):102－104．

［17］步星耀，張永福．骨髓間充質干細胞移植治療脊髓損傷［J］．實用診斷與治療雜志，2004，18(4):259－261．

［18］ Wu S，Suzuki Y，Noda T，et al．Bone marrow stroml cells enhance differentiation of cocultured neurosphere cells and promote regeneration of injured spinal cord．J Neurosci Res，2003，72(3):343．

［19］Lu P，Jones L L，Snyder E Y，et al．Neural stem cells constitutively secrete neurotrophic factors and promote extensive host axonal growth after spinal cord injury．Exp Neurol，2003，181(2):115．

［20］Nakamura M，Toyama Y，Transplantation of neural stem cells into spinal cord after injury．Nippan Rinsho，2003，61(3):463．

［21］吳榮強，許文榮．骨髓間質干細胞的臨床應用［J］．江蘇大學學報(醫學版)，2005，15(3):268－271．

［22］孫琦，王燦斌，劉繼春等．骨髓間充質干細胞治療骨關節病及脊髓損傷的研究進展［J］．中國組織工程研究，2012，16(36):6820－6826．

［23］代喜平，馮梅，盧愛麗等．間充質干細胞移植治療脊髓損傷患者的療效分析［J］．中國康復醫學雜志，2012，27(6):538－541．