NK細胞受體及其配體與結核分枝桿菌感染①

嚴 妍 王 易 劉 丹(上海中醫藥大學免疫學與病原生物學教研室，上海 201203)

NK細胞是抗腫瘤和病毒感染的重要的固有免疫細胞，也具有重要的抗結核作用。無須預先致敏就可以殺傷被感染的細胞，但NK細胞的有效活化依賴于其激活和抑制信號間的動態平衡，與其激活性和抑制性NK細胞受體(Natural killer receptor，NKR)及其靶細胞表面相應配體的表達或缺失密切相關［1］。在結核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，Mtb)感染時，機體的免疫系統會相應發生一系列生理病理改變。NK細胞及其受體、配體也會有相應變化。本文就近年來對NK細胞與Mtb感染的相互關系及NK細胞受體、配體與Mtb感染的相互關系的研究作一簡要綜述。

1 NK細胞與Mtb感染

NK細胞作為機體免疫系統的重要組成部分，在抗感染、抗腫瘤及移植排斥中起著十分重要的作用。在探索結核病防治的漫長過程中，越來越多的研究者將目光投向NK細胞。希望通過揭示NK細胞的抗Mtb感染機制，實現對結核病更為有效的防治。目前認為，作為重要的固有免疫細胞，NK細胞參與抗Mtb感染的固有免疫過程，對抵抗Mtb感染同樣具有重要作用。

1.1 NK細胞參與Mtb感染的發病過程 體內外研究顯示，NK細胞參與Mtb感染的發病過程。①對結核患者的研究顯示，與健康對照人群相比，肺結核患者外周血NK細胞水平和活性受到抑制，且此抑制與耐藥程度相關［2，3］。肺結核患者外周血中的NK細胞水平顯著低于非結核患者，且在不耐藥肺結核患者的水平明顯高于耐藥組。研究發現，結核病患者體內髓樣樹突狀細胞和淋巴樣樹突狀細胞數量和功能下調，并可以進一步通過下調IL-12和IL-15等細胞因子分泌，下調NK細胞水平和對Mtb感染巨噬細胞的裂解能力。②NK細胞可被趨化至Mtb感染的肺組織，參與抵抗Mtb感染。因為，在肺結核患者的肺組織中巨噬細胞和NK細胞數量明顯升高［4］。體外研究顯示，Mtb感染的人樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)可通過釋放 IFN-α/β，誘導 CXCL10表達，從而選擇性趨化NK細胞［5］。③在結核潛伏感染患者體內，NK細胞可通過調節分枝桿菌特異性CD8+CTL的活性，參與維持Mtb的潛伏感染狀態。Vankayalapati等發現去除健康個體來源的PBMC中的CD56+細胞，可導致Mtb特異性CD8+IFN-γ產生細胞的減少，并下調 CD8+T細胞裂解Mtb感染靶細胞的能力。而且在小鼠體內CD8+CTL對于維持Mtb的潛伏狀態至關重要［6］。④最近研究也顯示，活化的NK細胞可作為重要的固有免疫細胞，參與Mtb相關免疫重建綜合征(IRS)的病理機制。因為在經抗逆轉錄病毒治療(HAART)后出現IRS的HIV感染合并肺結核的病例中，活化的NK細胞數量明顯高于單純HIV感染及HIV/Mtb共感染患者［7］。⑤在BCG接種的人群中，NK細胞是IFN-γ的主要產生細胞，在抗分枝桿菌的免疫應答中發揮重要作用。文獻報道，BCG誘導臍血中NK細胞成熟，增強其細胞毒活性［8］。⑥在體外，NK細胞可促進對細胞內分枝桿菌的殺傷作用，促進對感染的單核細胞裂解，以控制結核分枝桿菌、BCG和鳥分枝桿菌在細胞內復制［9］。

1.2 NK細胞抵抗Mtb感染的可能機制 Mtb可以通過多種途徑激活NK細胞。人類NK細胞可以直接與Mtb或Mtb產物相互作用，誘導NK細胞增殖和細胞毒效應。BCG在體外誘導CD56brightNK細胞表達激活性受體NKp44，直接識別細菌成分［10］;也可通過TLR2直接識別Mtb產物，產生應答［11］。此外，NK細胞也可被Mtb感染的單核巨噬細胞或DC激活，發揮細胞毒效應。例如:Mtb的一種重要的38 kD脂蛋白抗原PstS-1可通過刺激單核巨噬細胞活化來加強NK細胞的細胞毒作用和ADCC效應［12］。NKp46、NKG2D等激活受體也可與Mtb感染的單核細胞相互作用，介導 NK 細胞活化［6，10］。

NK細胞亦可以通過多種不同機制抵抗Mtb感染。可發揮免疫調節作用，分泌促炎癥和免疫調節性細胞因子及趨化因子，作用于CD8+T細胞等其他效應細胞，調節對Mtb的固有免疫和適應性免疫;也可發揮細胞毒效應，直接裂解Mtb感染的宿主細胞，或直接殺傷細菌，抵抗Mtb感染［13］。大量的實驗證據表明，IFN-γ可能是人類NK細胞的主要效應機制，可通過多種機制介導對Mtb的早期抵抗。Mtb感染的PBMC可促進人NK細胞分泌IFN-γ;卡介苗BCG或BCG來源的PPD也可刺激NK細胞產生IFN-γ、穿孔素和粒酶A;肺結核患者的胸腔液中富含的CD56brightCD16+NK細胞是IFN-γ的主要來源;而在小鼠模型中，肺結核早期NK細胞即被激活并分泌 IFN-γ。IFN-γ 的產生有利于［5，14］:①誘導小鼠體內重要介質NOS2的產生，介導對分枝桿菌的殺傷活性;②調節中性粒細胞在肺組織中的浸潤和對Mtb的殺傷效應;③調節早期感染的肺組織炎癥;④促進CD8+T細胞對Mtb感染靶細胞的殺傷活性;⑤促進單核吞噬細胞產生IL-12和IL-18，誘導保護性Th1應答。在免疫缺陷小鼠，NK細胞也可通過IFN-γ依賴而T/B細胞非依賴的方式抵抗Mtb感染，抑制細菌復制及感染引起的肺損傷。NK細胞是通過CD40/CD40L途徑以及細胞因子級聯反應活化CD8+T細胞，依賴于NK細胞與被感染單核巨噬細胞間的細胞-細胞間接觸，可以被 CD40或CD40L 的抗體所拮抗［6］。

最近研究顯示，除了IFN-γ，NK細胞還可通過分泌IL-22，促進Mtb感染巨噬細胞的吞噬溶酶體融合，從而抑制Mtb的細胞內生長［5］。細胞因子IL-15和接頭蛋白DAP-10在體外促進Mtb誘導NK細胞產生IL-22。Mtb感染也可誘導巨噬細胞上調表達IL-22R 1，通過此受體促進細菌向溶酶體內遞送，促進吞噬溶酶體融合。在BCG免疫的小鼠中，NK細胞對于控制細菌復制、增強IL-22或IFN-γ介導的T細胞應答都具有重要作用。IL-2預先孵育和活化NK細胞3 d后，除了可通過分泌大量IFN-γ促進巨噬細胞活化，還可以促進NK細胞對Mtb感染巨噬細胞的直接殺傷活性［5］。故NK細胞作為重要的固有免疫細胞，參與抗Mtb感染的固有免疫過程，其活化及活化程度與Mtb感染結局相關。故進一步系統地介紹與NK細胞活性密切相關的NKR及其配體，以及其與Mtb感染的關系。

2 NKR及其配體與Mtb感染

對于NKR的描述有不同的分類方法，依據功能不同分為激活性NKR和抑制性NKR，依據分子結構不同分為免疫球蛋白樣受體和凝集素樣受體。國內較為常用的是以上兩種分類方法。但Lewis等［15］將NKR依據其配體的特異性分為MHCⅠ分子的受體(receptors for MHC classⅠ)、MHCⅠ相關分子的受體(receptors for MHC classⅠ-related ligands)和非MHC配體的受體(receptors for non-MHC ligands)。研究發現NKR及其配體表達的差異會影響NK細胞的抗Mtb的免疫效應。多種NKR及其配體參與對NK細胞細胞毒活性和免疫調節活性的調節。

2.1 MHCⅠ分子的受體與Mtb感染 MHCⅠ類分子是MHCⅠ類基因區編碼產物的總稱，包括經典的MHCⅠ類分子(HLA-A、-B、-C)和非經典的 MHCⅠ類分子(HLA-E、-F、-G)。目前認為它是多種NK細胞受體的配體。現已發現的以MHCⅠ類分子為配體的受體主要包括嚙齒類動物的Ly49受體、白細胞免疫球蛋白樣受體(Leukocyte Ig-like receptor，LIR)、人殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptors，KIR)及 CD94/NKG2 受體家族。從功能上分別屬于激活性NKR和抑制性NKR，都能特異性識別MHCⅠ類分子。

Ly49分子屬C型凝集素超家族，大多數Ly49分子為抑制性 NKR(如 Ly49A［16］)，但也有人在C57BL/6小鼠中發現其家族中Ly49D和Ly49H屬于激活性 NKR［17］。Ly49分子大部分識別 MHCⅠ類分子(如H-2K、H-2D)，但也有研究發現Ly49H與鼠巨細胞病毒(MCMV)感染細胞表面病毒糖蛋白m157具有高親和力［18］。白細胞免疫球蛋白樣受體(LIR)，又稱 Ig 樣轉錄物(Ig-Like Transcript，ILT)或CD85。人類 LIRB1-5 為抑制性受體，LIRA1、2、4、6為激活性受體，LIRA3作為一種可溶性分子，作用還不明確。這類受體的配體基本上涵蓋了所有的MHCⅠ類分子，包括 HLA-A、-B、-C、-E、-F 和 HLAG［19］。LIRB1還可高親和力結合UL18，一種由人巨細胞病毒編碼的與MHCⅠ結構同源的糖蛋白，可能與病毒的免疫逃逸相關［15］。這兩類受體與Mtb感染的關系目前還不清楚。

KIR受體是人類NK細胞高度進化過程中所特有的標志，人KIR基因位于染色體19q13.4，具有廣泛的多態性，其家族成員很多。不同成員的胞內段長度不同，一些受體具有含有1個或2個ITIM基序的長(L)胞內段結構域，可轉導抑制性信號;其他一些受體的短(S)胞內段結構域不含有ITIM基序，但具有結合帶有ITAM基序的接頭蛋白DAP12所需的賴氨酸殘基，介導激活性信號的轉導。其中，抑制性受體有 KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、KLRD1/KLRC1;激活性受體有 KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS4、KIR2DS5、KIR3DS1、KLRD1/KLRC2，還有一些尚未明確功能的受體KLRC3、KLRC4等，它們能夠識別HLA-A、HLA-B、HLA-C或HLA-E分子，但主要是HLA-C分子［15］。

目前發現KIR受體及其配體的表達，可影響NK細胞活性，與 Mtb易感相關。Portevin等［20］用Mtb H37Rv或BCG刺激健康人外周血來源的NK細胞，在IL-2存在的環境中，均能觸發NK細胞釋放IFN-γ和IFN-α，但是來源于不同個體的NK細胞對Mtb刺激的反應性相差達1 000倍。進一步分析發現高反應組個體會表達一種或多種非KIR2DS4的激活性受體，如 KIR2DS1、KIR2DS2、KIR2DS3、KIR2DS5或KIR3DS1，特別是KIR2DS3和KIR2DS5出現了過表達。提示激活性KIR受體可能作為保護性受體，賦予機體對Mtb感染的抵抗能力。分子遺傳學研究則顯示，KIR的配體HLA-B35:19/47-C*03單倍型是結核病的易感因素。當HLA-C*03表達升高時，其受體KIR2DL3亦升高，二者間結合可抑制NK細胞活性，與Mtb易感相關［21］。

CD94/NKG2受體家族是國內外研究比較多的一種NK細胞受體，屬C型凝集素超家族。在人、大鼠和小鼠均有表達，能特異性識別非經典的MHCⅠ類分子(人識別HLA-E，小鼠為Qa-1)。人類NKG2家族成員(NKG2A、-C、-E和-F分子)通常都與單個CD94分子結合，形成異二聚體［22］，小鼠的單個CD94分子可與 NKG2A、-C 和-E 分子結合［23］。現已研究比較清晰的NKG2A和NKG2B屬抑制性NKR，其胞內段含有2個ITIM基序，介導抑制性信號傳遞。NKG2C、NKG2E和 NKG2H屬于激活性NKR，與配體結合后可以招募帶有ITAM基序的接頭蛋白DAP-12，傳遞激活信號。NK細胞和T細胞上CD94/NKG2受體的表達受環境中細胞因子的影響，有研究發現IL-15、TGF-β及IL-12在體外均能誘導人T細胞CD94/NKG2受體的表達［15］。

研究顯示CD94/NKG2A受體可以負調節NK細胞功能，促使Mtb逃逸NK細胞介導的固有免疫殺傷。李軍等［24］用Mtb耐熱抗原體外刺激人外周血淋巴細胞，觀察其NKG2A和NKG2D受體表達的變化。發現在IL-2和抗原聯合刺激下，T細胞和NK細胞表面的抑制性受體NKG2A表達在第12天大幅度上升，NKG2A/NKG2D比例也明顯上升。提示Mtb耐熱抗原可通過促進抑制性受體NKG2A的表達，抑制NK細胞的活化。

2.2 MHCⅠ相關分子的受體與Mtb感染 MHCⅠ相關分子(MHC classⅠ chain-related，MIC)由MHC的非經典基因區編碼，與MHCⅠ類分子結構相似，但不能與肽結合向 T細胞提呈抗原［25］。其成員MICA和MICB是NKG2D受體識別的配體。與MHCⅠ類分子的廣泛表達不同，MIC通常僅僅局限地低表達于腸上皮細胞表面。但在腫瘤細胞或多種細菌和病毒感染細胞可被熱休克蛋白(HSP)誘導表達，故其作為壓力誘導分子，是誘導NK細胞激活的配體［26］。

NKG2D屬于NKG2家族，是識別MHCⅠ相關分子的受體。但NKG2D基因與NKG2家族中其他成員(NKG2A、NKG2C、NKG2E和 NKG2F等)的同源性很低，只與NKG2A基因的5'端非轉錄區有少量同源［22］，所以也被認為是命名不當。NKG2D也不與CD94結合，而是以同源二聚體的形成存在，是NKG2家族中一類特殊的激活性受體。它除了表達于NK細胞，還可組成性表達于CD8+T細胞表面。其表達水平受到環境中的細胞因子的影響，如Zhang等［27］研究發現 IFN-α能夠上調NKG2D的表達和而下調抑制性受體NKG2A的表達，而IFN-γ則可下調NKG2D和上調NKG2A表達。也有研究顯示其可被 IL-15和 TNF-α 上調，而被 TGF-β下調［15］。

在人類，NKG2D除了識別MICA和MICB，還識別UL16結合蛋白(UL16 binding protein，ULPB)1、-2、-3、-4、-5 和-6［28］。雖然 ULBP 不是由 MHC 基因編碼，但結構與MIC相似，都與MHCⅠ具有25%的同源性，屬于MHCⅠ家族的遠源成員(distant members of the MHC classⅠ family)。其中ULBP-1和-2可以與CMV編碼的U16跨膜糖蛋白相結合，MICB亦可。雖然ULBP表達較廣泛，但僅能與NKG2D低親和力結合。當病原體感染細胞時，可誘導ULBP表達增加并聚集于脂筏，增強其親和力。故與MIC相似，其作為壓力誘導分子，與感染誘導的NK活化密切相關［26］。人NKG2D受體與配體結合后，也可招募帶有ITAM基序的接頭蛋白DAP-10，傳遞激活信號。在小鼠，NKG2D識別的配體為視黃酸早期轉錄物(Retinoic acid early inducible transcripts，RAE)成員(RAE-1α、-1 β、-1γ、-1 δ 和-1ε)、次要組織相容性分子H60和小鼠ULBP樣轉錄物1(Mouse UL16-binding protein-like transcript 1，MULT 1)［29］。

目前多個研究都表明NKG2D及其配體的表達與Mtb感染相關。①Mtb感染的單核細胞可促進人NK細胞NKG2D表達增加，而且其配體UL-16和ULBP1也在受感染的單核細胞被上調表達，故NKG2D可能作為主要激活性受體，參與裂解Mtb感染的單核細胞和肺泡巨噬細胞［6］。②活化的NK細胞也可以通過NKG2D依賴的方式直接裂解Mtb產物特異性CD25+Foxp3+調節性T細胞(Treg)，并抑制其擴增。其配體ULBP1也可以在Mtb產物特異性Treg細胞上調表達，使用ULBP1抗體可抑制NK細胞對Treg的裂解，表明NKG2D與ULBP1間的相互作用介導對Treg細胞的裂解，并抑制Treg細胞擴增，調節對Mtb的早期應答［30］。③NKG2D還可以促進Mtb感染的人單核細胞和肺泡巨噬細胞分泌IL-23，并促進CD4+T細胞分泌IL-17。此效應可被抗NKG2D或抗ULBP1抗體所抑制［31］。④研究顯示，CD8+T細胞的NKG2D表達也與Mtb感染相關，影響CD8+T細胞介導的Mtb保護作用。在體外用抗體阻斷NKG2D功能，抑制Mtb特異性CD8+T細胞應答［32］。且與健康對照相比，肺結核患者的PBMC經Mtb體外刺激后，其NKG2D表達增加更顯著，在化學治療階段表達下調，而在成功治愈的患者則可恢復至較高水平。NKG2D水平可能與Mtb感染和治療不同階段，分別受到活菌、死菌、細菌釋放的抗原以及免疫病理產物等不同物質的刺激有關，并進一步影響CD8+T細胞的細胞毒作用［33］。

2.3 非MHC配體的受體與Mtb感染 在某些沒有MHCⅠ分子以及MHCⅠ相關配體表達的細胞，我們依然能見到NK細胞介導的細胞毒作用，這提示我們除了以上兩種配體外，NK細胞還可以通過其他配體被激活、發揮作用。現研究較多的可識別非MHC編碼配體的受體有NKR-P1受體、PILR受體、2B4受體、DNAM-1受體及自然細胞毒受體(Natural cytotoxicity receptor，NCR)等，大多都屬于激活性NKR。

小鼠NKR-P1受體，又稱NK1.1，屬凝集素樣受體。可以廣泛識別自身組織細胞、病毒感染細胞和某些腫瘤細胞上的糖類配體［15］。人NKR-P1受體家族包括NKRP1A、NKp80和NKp65，其配體是C型凝集素樣糖蛋白CLEC2亞家族(如:LLT1、AICL和KACL)，CLEC2也是由自然殺傷基因復合體(Natural killer gene complex，NKC)編碼，與其相應受體基因緊密連鎖［34］。PILR受體，是免疫球蛋白樣受體，分為抑制性PILRα受體和激活性PILR β受體，均能同其配體PILR-L結合，而發揮相應效用［15］。NK細胞的這兩類受體與Mtb感染間的關系，目前仍無相關報道。

2B4受體，又稱CD244，屬免疫球蛋白樣受體，是淋巴細胞信號激活分子(Signaling lymphocyte activation molecule，SLAM)家族成員，對 NK細胞和CD8+T細胞應答具有重要的調節作用。屬于激活性NKR，人類NK細胞能夠識別CD48，并激活NK細胞，促使其產生細胞毒作用和 IFN-γ釋放［15］。Roy等［30］發現Mtb刺激單核細胞產生的細胞因子可以促進NK細胞表達2B4，但抗2B4抗體不能抑制NK細胞的細胞毒性。對活動性結核病患者及Mtb潛伏感染個體的研究顯示，2B4在活動性肺結核患者的CD4+T細胞上的表達顯著高于潛伏感染者，且2B4信號對Mtb特異性CD4+T細胞的功能具有抑制作用，可下調其IFN-γ分泌的水平。也有研究顯示NK細胞的2B4并不總是展示其對NK細胞的激活效應，當低水平表達時，起激活作用;而當高水平表達時，則產生抑制性信號［35］。DNAM-1受體，又稱CD226，屬免疫球蛋白超家族。能夠識別CD112和CD155。研究表明DNAM-1受體與其配體結合后能增強NK細胞介導的細胞毒作用以及細胞因子的產生［36］。Marras等發現，用 BCG感染人臍血細胞和未成熟NK細胞，可促進未成熟NK細胞DNAM-1表達增加和IFN-γ分泌，與BCG激活免疫應答相關［37］。

NCR受體包括 NKp30、NKp44和 NKp46，其中NKp46和NKp30表達于活化和靜止的NK細胞，而NKp44只表達于活化的NK細胞。其配體是目前研究熱點，還不完全清楚。NCR受體可識別多種不同來源的配體，包括:病原體(細菌、病毒、寄生蟲)來源、腫瘤甚至自身細胞來源。流感病毒的血凝素HA是NKp46和NKp44的配體;NKp44識別登革熱病毒和西尼羅病毒的E蛋白;NKp46可識別核粒梭菌和Mtb上的未知配體;NKp30識別瘧原蟲PfEMP-1蛋白［38］。除了病原體，腫瘤細胞表達的BAT3和B7-H6分子是NKp30的配體;最近確定NKp44的配體NKp44L是表達于多種腫瘤、轉化或病毒感染細胞的MLL5蛋白的新型剪接體［39］。

多個研究表明NKp46和NKp44受體可能作為主要的激活性受體，識別Mtb感染的宿主細胞或直接識別Mtb來源的配體，激活NK細胞。①Nazneen等［40］在研究牛結核分枝桿菌時發現，牛 NKp46+CD2-NK細胞對宿主抗Mtb適應性免疫具有重要的調節作用。在感染早期，NKp46+CD2-NK細胞就可以通過選擇性表達淋巴歸巢因子和炎癥趨化因子受體(CCR2、CCR5、CCR6、CXCR3 及 CCR7)促使其向DC細胞的遷移。并通過分泌IFN-γ促進DC表達MHCⅡ分子，參與調節DC的抗原提呈能力。②人NKp46受體可在體外被Mtb感染的單核細胞產生的細胞因子誘導上調，并識別Mtb感染細胞表面的相應配體，介導NK細胞活化，參與裂解Mtb感染的靶細胞，且抗NKp46抗體可以抑制NK細胞殺傷活 性［10］。③Esin 等［10］還 發 現 人 NKp46 和NKp44受體還均可直接識別Mtb來源的配體，參與NK細胞活化和抗結核感染。BCG可在體外誘導CD56bright NK細胞表達NKp44受體，NKp44受體能夠識別Mtb細胞壁核心成分分枝酰阿拉伯半乳糖肽 聚 糖(mycolyl-arabinogalactan-peptidoglycan，mAGP)、分枝菌酸(Mycolic acids，MA)和阿拉伯半乳聚糖(Arabinogalactan，AG)。NK細胞可通過mAGP與NKp44受體間的直接識別被激活，并表達CD25、CD69、NKp44 和 IFN-γ，發揮免疫調節作用。但NKp46識別的Mtb成分目前還尚未確定。④在肺結核患者體內，NKp46和NKp30受體也可能參與對NK細胞的活性的調節。因為，肺結核患者表達NKp30和 NKp46的 CD56brightCD16+/-細胞數量減少，可導致 IFN-γ分泌減少，不利于對 Mtb的清除［2］。

3 小結與展望

從以上各項研究中我們看出，NK細胞在免疫應答中的作用不斷受到人們的重視，越來越多的研究者在研究NK細胞受體、配體及其與結核病等感染性疾病間的關系，并致力于更清楚明白的闡釋其中機制。我們也不難看出NK細胞主要通過細胞毒及免疫調節作用發揮其功能。對于Mtb感染，NK細胞可被Mtb以及Mtb感染的巨噬細胞或DC細胞直接激活，并直接作用于Mtb感染細胞，發揮細胞毒作用，進而殺滅潛藏在這些宿主細胞內的胞內菌。這為當前的抗結核治療提供了一條新思路，我們是否可以通過對已感染的吞噬細胞表面NKR配體加以調節，從而觸發NK細胞介導抗結核免疫反應呢?在傳統的抗癆方劑中是否也存在這樣的作用機制呢?目前對傳統中醫藥的研究還鮮有涉及到此方面的，以NKR及其配體為靶標的中藥免疫藥理研究在重新詮釋中藥治療作用及療效上，在對中醫臨床療效的突破上將產生值得關注的重大推動作用。

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