抗菌肽在水產動物飼料中的應用研究進展

于世亮，王裕玉，徐中玉，石 野，車建芳，楊雨虹＊

（東北農業大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱 150030）

抗菌肽，又稱抗微生物肽、抗生素肽，是一種具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，是生物體先天非特異性防御系統的重要組成部分 （廣慧娟等，2012；姜珊等，2011）。抗菌肽不僅對革蘭氏陽性菌、陰性菌有抑制作用，還能抑制或殺滅真菌、霉菌、原蟲和部分有包膜病毒等。這類活性多肽具有免疫原性小、熱穩定性好、水溶性好、抗菌譜廣等優點。已有研究表明，在動物日糧中添加抗菌肽能夠提高動物的生產性能和飼料利用率、改善動物腸道微生態環境、提高動物的免疫機能與抗病力（單安山等，2012）。此外，在飼料中添加抗菌肽，可以解決大量抗生素的使用導致致病菌產生耐藥性的問題。本文就抗菌肽的分類、作用機理及其在動物生產中的應用作一綜述。

1 抗菌肽的分類

抗菌肽在自然界分布廣泛，種類繁多。目前已經從細菌、真菌、植物、昆蟲、兩棲類動物、魚類、鳥類、哺乳類動物和人體中發現并分離2000多種具有抗菌活性的多肽。根據其來源可分為昆蟲抗菌肽，如昆蟲防御素（Insect defensins）、天蠶素（Cecropins）等；哺乳動物抗菌肽，如 α-防御素、β-防御素和θ-防御素等；水產動物抗菌肽，如貽貝肽（Myticins）、貽貝素（Mytilins）、魚類鐵調素（Hepcidin）等；兩棲類抗菌肽，如蛙肽、爪蛙肽等；植物抗菌肽，如硫素 （Thionin）、脂轉移蛋白（Lipid transfer proteins）等；微生物抗菌肽，如桿菌肽（Bacitracin）類等；人工抗菌肽，如合成抗菌肽、基因工程抗菌肽等。

根據結構可分為帶有α-螺旋結構的線性抗菌肽，如天蠶素、爪蟾抗菌肽；β-折疊、富含半胱氨酸、二硫鍵的抗菌肽，如植物防御素、昆蟲防御素、α和β防御素；具有環形結構的抗菌肽，如subtilosin A；富含甘氨酸、脯氨酸的線性抗菌肽，如holotricinⅡ、formaecins、abaecins。到目前為止，抗菌肽的分類存在較大爭議，但普遍認同的分類方法是依據抗菌肽的二級結構進行分類（Smith等，2010）。

2 抗菌肽的結構特點

抗菌肽的相對分子質量較小，是由20～60個氨基酸殘基組成的序列高度保守的短肽，其一級結構相似。抗菌肽的氨基酸N端富含賴氨酸和精氨酸等親水的堿性氨基酸，中間連接部分的結構則易于插入細胞膜，而C端富含甘氨酸或脯氨酸等疏水氨基酸，常被酰胺化（柳江楓等，2012）。大多數抗菌肽的一級結構中的特定位置有一些較保守的氨基酸殘基，例如，第2、5、11位氨基酸殘基為色氨酸、賴氨酸、天冬氨酸等，這些保守的氨基酸殘基保證了抗菌肽分子的抗菌活性（Boman等，1985）。此外，大多抗菌肽的熱穩定性較強，不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解（黎觀紅等，2011；王典等，2010）。

抗菌肽的功能主要決定于其高級結構。在一定條件下，抗菌肽可形成α-螺旋、β-折疊、環狀結構和伸展性結構4種二級結構。抗菌肽的高級結構與抗菌活性的關系為其分子改造和設計提供了理論依據，很多研究人員通過氨基酸替換、增強螺旋度、構建雜合肽等多種方式來獲得抗菌活性更強，抗菌譜更廣的新型抗菌肽。

3 抗菌肽的作用機理

國內外學者對抗菌肽的可能抗菌機制進行了大量研究，目前較為統一的觀點是將抗菌肽的抗菌機制總體上概括為膜結構破壞模式和非膜結構破壞模式兩種方式。

3.1 膜結構破壞模式 抗菌肽通過與細胞膜作用，使膜蛋白凝聚、失活，形成離子通道，引起膜通透性改變，最后導致細菌死亡。抗菌肽的殺傷作用依賴于多肽和細菌表面初始的引力，隨后抗菌肽與細胞質膜相互作用，這一引力很大程度上是帶正電荷的多肽和帶負電荷的細菌細胞壁之間的靜電作用（Huang，2000；Shai等，1999）。 也有研究認為，抗菌肽是通過與細胞膜上存在的特異性受體及其他因子協同作用而導致細菌死亡的，即胞內損傷機理。此模式機制包括三種模型，分別為桶板模型（Barrel-stave model）、環孔模型（Toroidal pore model）和地毯模型（Carpet models）。

桶板模型指抗菌肽通過靜電作用吸附到細胞膜表面，多個抗菌肽螺旋在細胞膜表面聚集形成中空的螺旋束結構，其中疏水性氨基酸殘基排列在螺旋束的外側與磷脂雙層相互作用，親水基團排列在螺旋束內側，桶板模型中抗菌肽形成跨膜孔洞，質膜完整性遭破壞，細胞膜內部分子通過孔洞滲透到胞外，進而實現抑菌作用 （Yang等，2001）。這一模式僅在少數抗菌肽 （如真菌alamethicin）中得到證實。

環形孔模型即跨膜孔模式，指抗菌肽插入到細胞膜內誘導脂質單層不斷彎曲，水分子嵌入，在環孔形成過程中，抗菌肽極性基團與脂質極性基團相互作用，脂質在正常片層結構上傾斜，最終連接到細胞膜兩側片層結構，在環孔形成中不斷彎曲，最后形成跨膜環孔（Yamaguchi等，2001）。 該模式與桶板模型區別在于：該模型中即使抗菌肽垂直嵌入到質膜雙層上，抗菌肽也總是與脂質的頭部相互作用。

地毯模型是指抗菌肽依靠靜電吸附與細胞膜上陰離子型磷脂頭部基團相互作用，然后在質膜表面積累并平行排列，像地毯一樣覆蓋在質膜表面。當濃度逐漸增大到臨界值時，抗菌肽像去污劑一樣裂解細胞膜形成膠團狀物質。在臨界值濃度下，抗菌肽在細胞膜上形成暫時性環孔，抗菌肽通過環孔進入到質膜內部，由于質膜雙層結構遭破壞導致了膜不完整性和微膠團物形成，從而達到殺菌的目的。蛾血淋巴中的抗菌肽cecropin A以及富含色氨酸的抗菌肽indolicidin等均是利用此種機制來破壞細胞膜的（單安山等，2012）。

3.2 非膜結構破壞模式 少數抗菌肽，如馬蹄蟹體內的抗菌肽Tachyplesins能在不引起細胞膜結構破壞的情況下快速穿膜，抗菌肽需要先通過靜電作用與細菌胞膜相互吸引而結合。抗菌肽穿透質膜后在胞內累積，通過與胞內靶位點特異性結合抑制DNA復制、RNA合成、蛋白質合成、細胞分裂、胞內物質代謝以及細胞信號轉導等生理過程，從而達到抑制、殺滅細菌的目的（王興順等，2012；Hirakura 等，2002）。

此外，抗菌肽還可以通過其他的方式產生抗菌效果，包括抑制細胞的呼吸作用、抑制細胞壁形成、抑制蛋白質或核酸的合成等，某些富含脯氨酸的抗菌肽還可與細菌的熱休克蛋白結合而發揮抗菌活性。

4 抗菌肽在水產動物生產中的應用

4.1 提高成活率 抗菌肽作為飼料添加劑對細菌具有明顯的抑制作用。Zasloff（2002）對斑節對蝦的研究結果顯示，飼料中添加抗菌肽Mytilin可以顯著提高其成活率及抗白斑病毒感染能力。研究發現，飼料中添加抗菌肽可以顯著提高凡納濱對蝦（宋理平等，2010）和南美白對蝦（王廣軍等，2005）的抗病能力。黃滄海等（2009）研究表明，抗菌肽能顯著提高羅非魚幼魚抑菌作用。Chiou等（2009）研究報道，重組抗菌肽Chelonianin可以有效地控制感染哈氏弧菌羅非魚的炎癥發生并能降低其死亡率。姜珊等（2011）對飼喂抗菌肽的羅非魚進行嗜水氣單胞菌的攻毒試驗，結果發現，當添加量為5～20 mg/kg時，嗜水氣單胞菌攻毒后的死亡率顯著降低，證明攝食抗菌肽可以顯著提高羅非魚的抗病能力，可能是由于抗菌肽在魚體內直接發揮殺菌的作用，也可能與抗菌肽提高了抗氧化酶與溶菌酶的活力有關。但高劑量抗菌肽卻未能顯著提高羅非魚的成活率，可能是因為高劑量抗菌肽破壞了腸道菌群平衡，在殺滅腸道有害菌的同時破壞了有益菌的生長環境，也可能與免疫相關酶類的活性降低有關。

4.2 提高生產性能 在飼料中添加抗菌肽，可提高飼料利用率，促進水產動物生長。李曉穎等（2013）用20%、40%、60%富含抗菌肽乳酸菌發酵豆粕替代 （56.0±0.56）g羅非魚飼料中的魚粉，結果顯示，20%組羅非魚增重率、飼料系數與對照組差異不顯著，但均顯著高于40%組和60%組。宋理平等（2010）研究表明，在（0.10±0.01）g 凡納濱對蝦飼料中添加10g/kg重組抗菌肽制劑后，對蝦成活率提高8.41%，相對增重率提高27.60%。陳冰等（2010）在（0.86±0.01）g 凡納濱對蝦飼料中添加 0 ～5000 mg/kg家蠅抗菌肽提取物，結果顯示，當抗菌肽提取物添加量為2000～3000 mg/kg時，對蝦成活率、增重率、特定生長率、飼料效率顯著高于對照組。柴仙琦等（2012）報道，飼料中添加300 mg/kg抗菌肽后，凡納濱對蝦的增重率提高8.76%，飼料系數降低12.5%，而400 mg/kg和500 mg/kg組與對照組相比較差異不顯著。姜珊等（2011）研究結果顯示，飼料中添加5～10 mg/kg抗菌肽可以顯著提高羅非魚的終、末體質量和增重率。由此可見，在飼料中添加適量抗菌肽對水產動物有促生長作用，可能是因為抗菌肽抑制腸道有害微生物，促進腸道微生物菌群平衡，進而產生促生長的作用。但抗菌肽添加過量會導致凡納濱對蝦（柴仙琦等，2012；陳冰等，2010）和羅非魚（姜珊等，2011）增重率降低，這可能是因為高劑量抗菌肽會抑制腸道中有益菌群的生長，影響動物體的消化吸收。

4.3 改善免疫功能 當動物體受到細菌、真菌和病毒等病原微生物入侵時，抗菌肽作為免疫效應分子來啟動、調節宿主免疫防御體系，從而促進免疫功能以消除感染，保護宿主免受病原微生物侵害（周洪波等，2009）。宋理平等（2010）研究了抗菌肽對凡納濱對蝦非特異性免疫的影響，結果表明，與對照組相比，飼料中添加10 g/kg抗菌肽后，總抗氧化能力顯著提高，而對溶菌酶活性和超氧化物歧化酶活性影響均不顯著；水浴攻毒后，超氧化物歧化酶活性提高77.40%，總抗氧化能力提高453.16%。柴仙琦等（2012）研究報道，在凡納濱對蝦飼料中添加抗菌肽后，可顯著提高血清非特異性免疫功能。陳冰等（2010）研究飼喂不同水平抗菌肽提取物對凡納濱對蝦血細胞數、吞噬率和免疫相關酶活性的影響，結果表明，與對照組相比，添加2000～5000 mg/kg抗菌肽提取物可顯著提高對蝦血細胞數量；2000～4000 mg/kg組對蝦血細胞吞噬率顯著提高。添加量為2000～3000 mg/kg時，對蝦血清中酚氧化酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、溶菌酶的活性和總抗氧化能力均維持在一個較高的水平，且顯著高于對照組，與對照組相比較，3000 mg/kg組溶菌酶的活性提高1.6倍。王一娟等（2011）研究表明，在河蟹飼料中添加0.4%抗菌肽可以顯著提高肝臟、肌肉組織中超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力，顯著降低血清谷丙轉氨酶、球蛋白及肝臟、肌肉、性腺中丙二醛濃度。李曉穎等（2013）的研究指出，對照組和20%組羅非魚血清中溶菌酶的含量在整個試驗過程中均呈上升趨勢，而40%組和60%組的含量呈逐漸下降的趨勢。姜珊等（2011）研究結果顯示，飼料中添加5～10 mg/kg抗菌肽可以顯著提高羅非魚紅細胞總數、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性，說明適量地添加抗菌肽可以提高機體抗氧化酶活力。然而，當添加量為50mg/kg時，肝臟的超氧化物歧化酶與血清中溶菌酶活性顯著低于對照組，可能是因為抗菌肽添加量過高時，毒性太強，破壞了肝臟的組織結構與血液組分，導致酶活性下降。

4.4 改善產品品質 對蛋雞 （呂尊周等，2012）、蘆花雞（郭麗君等，2012）、奶牛（徐名能等，2011）的研究指出，日糧中添加抗菌肽制劑能改善動物產品品質，但關于抗菌肽對水產品品質影響的研究還未見報道，有待于進一步的研究。

5 小結

綜上所述將抗菌肽添加到水產飼料中，不僅可以提高生產性能、魚體的免疫力，而且可以提高水產品質量，是一類極具發展前景的新型抗微生物制劑。對于抗菌肽作為飼料添加劑的可行性雖然已經有了一定的進展，但并不深入，還需要更深入和更系統的研究：（1）構建基因工程菌，提高其表達量，改進分離和純化技術。（2）研究抗菌肽的免疫原性、安全性、藥理學、毒理學、藥代動力學及其作用機制等。（3）由于易被動物體內的蛋白酶降解，需要在不影響其抗菌活性的基礎上，提高其體內穩定性。（4）其對動物細胞有一定的細胞毒性，在保持其結構與活性的同時，降低其細胞毒性。相信隨著分子生物學及基因工程技術在抗菌肽研究與開發領域的應用，這些問題將逐步得到解決，抗菌肽將對水產養殖業的可持續發展將起到重要的作用。

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