熱敏通道：“寒者熱之，熱者寒之”的細(xì)胞和分子生物學(xué)意義?

楊 楨，高 琳，趙紅霞，蘆 沖，李 冀

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

寒熱概念是中醫(yī)理論體系中的核心概念之一，它常用以說明人體生理病理的狀態(tài)，界定中藥的性能。寒熱理論貫穿于中醫(yī)的理法方藥全過程，臨床辨治中常依據(jù)寒熱理論確立治療大法，成為指導(dǎo)組方的重要準(zhǔn)則。

《素問·至真要大論》中的“寒者熱之，熱者寒之，溫者清之，清者溫之”是針對(duì)寒熱證候最重要的治療大法。筆者梳理近10余年的相關(guān)文獻(xiàn)，試圖從熱敏通道(Thermo TRP channels)的角度，對(duì)寒熱證的發(fā)生以及“寒者熱之，熱者寒之”治法可能的細(xì)胞和分子生物學(xué)內(nèi)涵進(jìn)行初步探討。

TRP是transient receptor potential(瞬時(shí)受體電位)的簡(jiǎn)稱，它們是一類非特異性的離子通道，是我們感官系統(tǒng)的哨兵，能感知光線、溫度、觸覺、疼痛、滲透壓、味覺等刺激。溫度敏感TRP離子通道(thermo-sensitive TRP ion channels，文中簡(jiǎn)稱熱敏通道)主要是對(duì)溫度敏感的離子通道。熱敏通道的發(fā)現(xiàn)始于對(duì)辣椒的研究。N.JANCS首先提出辣椒中所含的辣椒素參與了激活感知痛覺的神經(jīng)元活動(dòng)[1]。隨后研究者發(fā)現(xiàn)，辣椒素不僅可用于研究傷害性感受器初級(jí)傳入的神經(jīng)生物學(xué),而且通過辣椒素建立了新的研究慢性疼痛的方法[2]。第一個(gè)熱敏通道是1997年發(fā)現(xiàn)的，UCSF的科學(xué)家在研究辣椒素作用靶點(diǎn)的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)了辣椒素受體，并成功將其克隆，命名為香草酸受體亞型1(Vanilloid receptor subtype 1,VR1)[3]，后改名為TRPV1，亦稱辣椒素受體，成為最受人矚目的“熱激活離子通道(Heat-activated ion channel)”。這個(gè)發(fā)現(xiàn)開啟了從分子層面認(rèn)識(shí)寒熱的新時(shí)代。

在隨后的研究中，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)熱敏通道及其激動(dòng)劑，其中諸多寒熱特性明顯的中藥，如胡椒、花椒、生姜、肉桂、薄荷、菊花、白芥子等都含有激動(dòng)熱敏通道的有效成分。

1 熱敏通道家族概況

到目前為止，有6個(gè)熱敏通道已經(jīng)分離出來，均表達(dá)于皮膚和/或感覺神經(jīng)元并可被溫度激活。其中溫?zé)嵬ǖ烙?個(gè)：TRPV1(≥43℃，近似的溫度激活閾值，下同)，TRPV2(52℃)，TRPV3(32℃～39℃)和TRPV4(27～34℃)；寒涼通道有2個(gè)：TRPM8(25℃～28℃)和TRPA1(≤17℃)。

從熱敏通道所對(duì)應(yīng)的激活溫度可見，機(jī)體對(duì)寒熱的感知與中醫(yī)寒涼溫?zé)崴男杂芯畹膶?duì)應(yīng)關(guān)系：寒-TRPA1，涼-TRPM8，溫-TRPV3、TRPV4，熱-TRPV1、TRPV2，兩者之間共同的生物學(xué)基礎(chǔ)就是人體的寒熱感覺。因此，從熱敏通道的角度入手，來探究中醫(yī)寒熱病證的現(xiàn)代生物學(xué)意義，進(jìn)而挖掘中醫(yī)臨證治療大法“寒者熱之、熱者寒之”的分子生物學(xué)本質(zhì)，當(dāng)是一種行之有效的方法。

2 熱敏通道：感受寒熱細(xì)胞和分子生物學(xué)基礎(chǔ)

熱敏通道的每個(gè)通道都有其特性，有復(fù)雜和迥異的調(diào)節(jié)路徑，其中有些過程是類似的。

熱敏通道是非特異的陽離子通道，溫度、機(jī)械刺激、某些外源性和內(nèi)源性化學(xué)物質(zhì)均可激活[4]。它們能夠?qū)⒋罅康奈锢砗突瘜W(xué)刺激整合，產(chǎn)生積分效應(yīng)，經(jīng)過中樞處理產(chǎn)生多種感覺。為應(yīng)對(duì)性質(zhì)迥異的刺激，熱敏通道的構(gòu)建蛋白質(zhì)是模塊組合式的結(jié)構(gòu)，具有獨(dú)特的變構(gòu)能力，有多空間形態(tài)的門控功能，不同的信息引起分子構(gòu)象的特異改變，從而開啟相應(yīng)通道。它將某一類結(jié)構(gòu)賦予溫度依賴的調(diào)節(jié)，而另外的結(jié)構(gòu)賦予電壓依賴的調(diào)節(jié)。運(yùn)用熱力學(xué)的某些原理，可以解釋熱敏通道被冷或熱激活，直接由溫度門控[5]。

熱敏通道由G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)調(diào)制。組織損傷或炎癥過程中釋放許多炎癥介質(zhì)如前列腺素、緩激肽和蛋白酶等，它們結(jié)合到GPCRs引起PKs(protein kinase，蛋白激酶)如PKA、PKC的下游激活；這些絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化熱敏通道，調(diào)節(jié)其熱閾值，再通過一系列激動(dòng)劑影響其門控開關(guān)[6]。熱敏通道也接受生長因子(NGF、GDNF)的調(diào)控。結(jié)合本文的目的，在此僅介紹熱敏通道中熱通道代表TRPV1和寒通道代表TRPA1的部分特性。

2.1 熱通道的代表TRPV1及其特性

TRPV1通道廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)，中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)組織均存在。TRPV1廣泛表達(dá)于三叉神經(jīng)節(jié)(TG)和背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的中小神經(jīng)元上，這些神經(jīng)元主要負(fù)責(zé)傷害性刺激的傳入。幾乎各種組織如皮膚、膀胱、胃腸道、牙髓、肺和前列腺的神經(jīng)纖維中均有TRPV1表達(dá)；在一些非神經(jīng)組織，如人皮膚的表皮角化細(xì)胞、胃上皮細(xì)胞、尿路的上皮細(xì)胞和平滑肌也有TRPV1分布。

在TRPV1的激活劑中最有代表性的是溫度、辣椒素和酸度。43℃以上的溫度可以激活TRPV1通道。在自然狀態(tài)下，43℃大致上是誘發(fā)人和某些動(dòng)物熱痛的閾值。辣椒素能夠激發(fā)局部的熱痛麻木感，而酸性環(huán)境(pH≤6)也能激活TRPV1通道。如氫離子大量出現(xiàn)在受傷害組織中，導(dǎo)致組織酸化，而氫離子、熱和某些激動(dòng)劑之間的互動(dòng)，就導(dǎo)致了傷害部位的熱痛酸脹感。此外，多種內(nèi)源性炎癥介質(zhì)，通過多個(gè)信號(hào)通路(包括PLC/PKC、PKA、ERK/MAPK和PI3K/Src)致敏TRPV1，產(chǎn)生熱或痛感[7]。因此，針對(duì)TRPV1的激動(dòng)劑或抑制劑可以治療疼痛和發(fā)熱相關(guān)病證，調(diào)控TRPV1有止痛和調(diào)節(jié)體溫的作用[8～10]。

2.2 寒通道的代表TRPA1及其特性

TRPA1是最明確的冷痛受體，是一種冷毒感受器，讓人產(chǎn)生不愉快的冷痛感[11]。其分布臟器與TRPV1大致相當(dāng)，在神經(jīng)組織中TRPA1幾乎與TRPV1同行。表達(dá)TRPA1的感覺神經(jīng)元中有97%也表達(dá)TRPV1，而表達(dá)TRPA1的神經(jīng)元只有30%表達(dá)TRPV1[12]。

TRPA1也是諸多化學(xué)和物理因素的感受器，它感受的溫度是≤17℃。最有代表性的TRPA1激動(dòng)劑是芥末油和肉桂醛，前者來自于芥末，后者來自于肉桂。一些內(nèi)源性炎癥介質(zhì)也能激活TRPA1。研究顯示，TRPA1介導(dǎo)持續(xù)的慢性疼痛與該通道的持續(xù)活化有關(guān)。

TRPV1與TRPA1關(guān)系密切，有一種假說認(rèn)為TRPV1和TRPA1在細(xì)胞膜上形成一個(gè)復(fù)合體，使得TRPV1影響TRPA1通道的內(nèi)在特征[13]。TRPA1對(duì)TRPV1的依賴較高，二者關(guān)系緊密，在產(chǎn)生疼痛方面產(chǎn)生積分效應(yīng)，有“犯罪搭檔”之稱[14]。寒熱通道之間的多樣性聯(lián)系，可以深入理解中醫(yī)理論中寒熱的依存、轉(zhuǎn)化等復(fù)雜關(guān)系。

3 寒證與熱證的產(chǎn)生：通道致敏與組織敏化

根據(jù)上述原理，我們可以從熱敏通道角度討論相關(guān)寒證和熱證的產(chǎn)生。

在發(fā)炎區(qū)域由于存在大量炎癥因子，它們?nèi)菀准せ顭崦敉ǖ溃@種情況稱為區(qū)域敏化。熱敏通道致敏后易引發(fā)與寒熱和慢性疼痛狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的過敏癥[15]，產(chǎn)生以冷、熱、痛等為核心的病理證候。

3.1 熱證

熱敏通道的配體辣椒素、芥子油、肉桂醛等本質(zhì)上說都是敏化劑，它們能夠降低熱敏通道的閾值。其中有些化合物是直接結(jié)合到熱敏通道上，是熱敏通道的直接活化劑；還有一些化合物則不與熱敏通道結(jié)合，而是間接影響熱敏通道的功能，是單純的敏化劑[16]。如辣椒素的濃度即使不能產(chǎn)生活化電流，也能使得TRPV1通道對(duì)酸(氫離子)和熱敏感；同樣酸可以讓TRPV1通道對(duì)熱和辣椒素敏感。在一定的酸性環(huán)境下(如PH≤6)，即使在室溫(24℃)，也能激活TRPV1受體[17]，產(chǎn)生熱辣感。大多數(shù)介質(zhì)通過受體途徑(如受體酪氨酸激酶和GPCR)發(fā)揮作用，但是氫離子直接致敏TRPV1。這可以解釋為什么燒心、胃脘周圍的疼痛如此常見。原則上，溫度或局部酸度升高可增加部分TRPV1激動(dòng)劑的功效，使得那些不產(chǎn)生或者僅產(chǎn)生輕微疼痛的配體表現(xiàn)出顯著毒性，產(chǎn)生較重的病理變化。據(jù)此可以推論：其他條件不變，組織酸化就會(huì)引起發(fā)熱或疼痛的感覺。

此外，某些氧化還原反應(yīng)中的活性物質(zhì)可以直接調(diào)節(jié)TRPV1通道的活性。特別是在氧化還原反應(yīng)發(fā)生變化的組織中出現(xiàn)增強(qiáng)效應(yīng)，如局部缺血和/或炎癥時(shí)，導(dǎo)致痛覺過敏[16]。可見熱證的產(chǎn)生是多種因素在同一熱敏通道上產(chǎn)生的加分效果，因此也稱其為積分器。

3.2 寒證

與TRPV1通道正好相反，在炎性條件和激動(dòng)劑存在的前提下，略微降低溫度則可使TRPA1快速敏化，有人在室溫或生理溫度時(shí)產(chǎn)生冷或冷痛感。

體外實(shí)驗(yàn)觀察到，當(dāng)TRPA1激動(dòng)劑(如內(nèi)源性的炎癥因子)作用下，輕微的降溫就可導(dǎo)致TRPA1大幅度開放，引起強(qiáng)烈的跨膜電流，產(chǎn)生較強(qiáng)的動(dòng)作電位(該沖動(dòng)經(jīng)由三叉神經(jīng)節(jié)或背根神經(jīng)節(jié)經(jīng)脊髓傳導(dǎo)至大腦，經(jīng)大腦整合產(chǎn)生強(qiáng)冷感和痛感)；如果TRPA1激動(dòng)劑不存在，即使是冷毒(17℃以下)也只會(huì)導(dǎo)致電流的輕微改變[11](產(chǎn)生輕微的冷或冷痛感)。該實(shí)驗(yàn)解決了一個(gè)問題，就是并不需要到生理上TRPA1激活的溫度，TRPA1即可啟動(dòng)。這就解釋了為什么在某些情況下，輕度的冷卻會(huì)讓有些人感到非常冷。

人類的慢性疼痛有一個(gè)顯著特點(diǎn)，就是對(duì)冷敏感，常表現(xiàn)為怕冷或冷痛。體外實(shí)驗(yàn)證明，肉桂醛達(dá)到閾值，誘導(dǎo)去極化激活TPRA1的時(shí)間比辣椒素激活TRPV1慢得多；另一方面，在等效濃度情況下，肉桂醛激發(fā)的動(dòng)作電位次數(shù)卻比辣椒素多得多。TRPA1具有這種慢活化與慢失活特性，使得傷害感受神經(jīng)元感受到長時(shí)間的冷痛[18]。

在細(xì)胞內(nèi)的TRPA1氨基末端結(jié)構(gòu)域，許多激動(dòng)劑通過共價(jià)結(jié)合到其反應(yīng)性殘基，激活TRPA1。由于TRPA1的這些親電激動(dòng)劑的共價(jià)修飾是不可逆的，TRPA1激動(dòng)劑通常出現(xiàn)長時(shí)間的殘留活性，持續(xù)可達(dá)1個(gè)多小時(shí)，而其他通道的激活僅僅持續(xù)數(shù)秒到數(shù)分鐘[19]。在損傷或炎癥部位持續(xù)釋放的內(nèi)源性激動(dòng)劑激活，因此長時(shí)間激活TRPA1。

另外，感覺神經(jīng)細(xì)胞表面TRPA1的數(shù)量是變化的。在某些TRPA1激動(dòng)劑作用下，感覺神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的囊泡與細(xì)胞膜融合，使得膜面積增加，囊泡上的TRPA1易位到細(xì)胞膜上，TRPA1的數(shù)量因此增加，進(jìn)而發(fā)生比較劇烈的寒冷感或冷痛感[20]。

可以看到，有多種機(jī)制使得TRPA1在激動(dòng)劑作用下長時(shí)間、高強(qiáng)度活化，這可以理解為什么慢性疼痛多為冷痛、寒證。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，TRPA1特異性拮抗劑可以逆轉(zhuǎn)各種病理?xiàng)l件下持續(xù)性疼痛。

熱敏通道分布的廣泛性、對(duì)神經(jīng)感覺的主宰意義、對(duì)傷害性感受的特性以及與炎癥的密切關(guān)系，使得寒熱之證廣泛存在。

4 寒熱證治療大法：寒者熱之、熱者寒之

基于對(duì)熱敏通道的理解，既然傷害性感受器的熱敏受體敏化和過敏是熱證、寒證形成的基礎(chǔ)，那么治療尋求熱敏通道的脫敏就成為必然之選。TRPV1和TRPA1的許多激動(dòng)劑能以異源脫敏的方式脫敏這2個(gè)通道，有證據(jù)顯示，這2個(gè)通道的依存度極高，在交叉脫敏中聯(lián)合發(fā)揮作用[21]。對(duì)于寒熱證的治療，其本質(zhì)或許是使熱敏通道脫敏。

中醫(yī)關(guān)于寒證與熱證最重要的治法還是寒者熱之和熱者寒之，逆敏化現(xiàn)象和寒熱通道之間的交叉脫敏原理可能部分反映該治法的分子本質(zhì)。

4.1 溫度改變與逆敏化

最直截了當(dāng)處理寒熱證的辦法莫過于熱敷冷敷。將熱痛的組織冷敷、將冷痛的組織熱敷就是一個(gè)逆敏化過程，使得溫度誘導(dǎo)的敏化得以消除，這是某種意義上的脫敏。

一個(gè)芥子油誘導(dǎo)的冷痛實(shí)驗(yàn)可以觀察到這樣的事實(shí)：在23℃的時(shí)候，轉(zhuǎn)染TRPA1通道的細(xì)胞可以產(chǎn)生類似冷痛的電流脈沖；當(dāng)溫度提高到34℃的時(shí)候，該電流脈沖幅度幾乎減少一半；當(dāng)實(shí)驗(yàn)溫度升高到39℃時(shí)，這個(gè)電流脈沖幾乎消失。也就是說，這時(shí)幾乎感知不到冷或冷痛了，TRPA1通道已經(jīng)完全脫敏。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明，升高的溫度抑制了TRPA1激動(dòng)劑的活性，導(dǎo)致TRPA1通道脫敏[22]。

由此可以看出，冷溫度是TRPA1的正調(diào)節(jié)，而熱溫度則是TRPA1的負(fù)調(diào)節(jié)。這種溫度引起的脫敏一定需要其他激動(dòng)劑的存在。炎癥或受傷害組織部位的溫度常常會(huì)升高3～4℃，這也許是一種自我保護(hù)，使得TRPA1的活性降低，減輕冷感或疼痛。

4.2 寒熱通道之間的交叉脫敏

TRPV1和TRPA1通道的部分激動(dòng)劑具有交叉脫敏作用，并發(fā)揮熱者寒之或寒者熱之的功效。

以人體實(shí)驗(yàn)來說明交叉脫敏。辣椒素和芥末油分別作用于TRPV1和TRPA1，實(shí)驗(yàn)中分別涂抹于受試者的口腔，引起舌頭劇烈的刺激性疼痛，這是自致敏。實(shí)驗(yàn)繼續(xù)，每分鐘給藥1次，大約5 min后，舌頭上的刺痛感顯著降低。繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，將辣椒素和芥末油交叉使用，仍然感覺不到明顯的刺痛感[23]。有大量實(shí)驗(yàn)證明，TRPV1和TRPA1通道之間存在這種異源交叉脫敏[13,21]。

另外一個(gè)以大鼠的后爪皮膚為材料的實(shí)驗(yàn)顯示，在感覺神經(jīng)元上反復(fù)使用辣椒素可以使得細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平升高，通過去磷酸化作用，導(dǎo)致鈣依賴和磷酸酶依賴的TRPV1通道同源脫敏；對(duì)芥子油的異源脫敏也是通過鈣依賴途徑實(shí)現(xiàn)的。而TRPA1通道對(duì)芥子油的同源脫敏是非鈣離子依賴性途徑；對(duì)辣椒素的異源脫敏則是通過鈣離子依賴性途徑實(shí)現(xiàn)的。交叉脫敏在動(dòng)物大體和傷害性防御測(cè)試中都能觀察到[21]。

以這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果解釋溫?zé)嶂兴幍氖褂茫銐蛄康暮蠺RPV1激動(dòng)劑的溫?zé)崴帲梢允垢缓杏X神經(jīng)的炎性組織致敏，產(chǎn)生溫?zé)岣校浜筮M(jìn)一步使得該組織脫敏；與此同時(shí)，這些溫?zé)崴幰材苁沟肨RPA1通道脫敏，不再受該寒通道激動(dòng)劑(如引起神經(jīng)炎性冷痛的緩急肽)的活化，從而產(chǎn)生散寒效應(yīng)。

最有名的溫里藥干姜、花椒、胡椒、吳茱萸等辛辣成分都是TRPV1激動(dòng)劑，能逆轉(zhuǎn)TRPA1活化引起的冷痛，發(fā)揮散寒止痛作用。而菊花、蟬衣、芥末油、肉桂醛則是TRPA1激動(dòng)劑，薄荷則是TRPM8激動(dòng)劑，它們都能交叉脫敏TRPV1發(fā)揮清熱作用。

5 結(jié)語

中醫(yī)寒熱理論和方藥涉及非常豐富的內(nèi)容，熱敏通道為深入理解寒熱相關(guān)問題打開了一扇窗戶，從一個(gè)獨(dú)特的視角解讀古老中醫(yī)。但有些問題是顯而易見的，如熱敏通道之間的差異性很大，研究?jī)?nèi)容依然不足；動(dòng)物模型與人體差異大，尤其是寒通道還不足以理解人類復(fù)雜的寒熱感受，許多矛盾與差距亟待彌補(bǔ)。目前來看，熱敏通道理論和中醫(yī)理論有脫節(jié)和不協(xié)調(diào)之處，這是由于研究和認(rèn)識(shí)不充分的緣故，隨著研究的深入相信很多問題會(huì)迎刃而解。還有很多基本概念，如辛溫、辛涼、辛溫發(fā)汗、溫肺化飲、溫經(jīng)散寒、溫經(jīng)止痛等，運(yùn)用熱敏通道理論都可以得到更加豐富的理解。如何讓這些理論自然融入到中醫(yī)理論體系中則是一個(gè)挑戰(zhàn)。現(xiàn)在已經(jīng)出現(xiàn)一道曙光，從分子水平認(rèn)識(shí)和發(fā)展中醫(yī)，其契合度非常高，比以往任何時(shí)候都要自然而親切。

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