線粒體DNA穩定性與疾病的關系*

黃珊，高文祥，高鈺琪

(1蚌埠醫學院病理生理學教研室，安徽蚌埠 233030;2第三軍醫大學高原軍事醫學系病理生理學與高原生理學教研室，全軍高原醫學重點實驗室，高原醫學教育部重點實驗室，重慶 400038)

線粒體DNA穩定性與疾病的關系*

黃珊1，高文祥2△，高鈺琪2

(1蚌埠醫學院病理生理學教研室，安徽蚌埠 233030;2第三軍醫大學高原軍事醫學系病理生理學與高原生理學教研室，全軍高原醫學重點實驗室，高原醫學教育部重點實驗室，重慶 400038)

線粒體;線粒體DNA;穩定性

線粒體是真核細胞內進行氧化磷酸化和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)合成的細胞器，為細胞活動提供能量，有“細胞動力工廠”之稱。此外，線粒體還是細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)產生的主要場所，并能啟動和執行細胞的凋亡［1］。線粒體由核基因和線粒體基因組共同編碼，其DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和(或)核DNA (nuclear DNA，nDNA)的遺傳缺陷均可引起線粒體功能障礙而導致疾病發生。

1 線粒體DNA

mtDNA為一環狀雙鏈DNA分子，由位于外側的重鏈(H)和位于內側的輕鏈(L)組成。人的mtDNA 長16 569 kb，編碼13個氧化磷酸化相關的多肽、22 個tRNA和2個rRNA。與nDNA相比，mtDNA在結構和功能上有其獨特的特點:(1)線粒體是半自主細胞器。絕大部分構成線粒體的蛋白以及mtDNA復制、重組、轉錄等過程所需的酶均由nDNA編碼，而mtDNA基因的復制、轉錄和翻譯則受nDNA調控。(2)每個細胞平均有100～1 000個線粒體，每個線粒體內又有多個mtDNA拷貝，因此同一個體可以同時存在2種或2種以上類型的mtDNA，即線粒體的異質性。突變型mtDNA是否在組織產生表型效應，與突變型mtDNA與野生型mtDNA的相對比例和組織的能量消耗程度有關。(3)mtDNA存在多態現象，2個無關個體的mtDNA堿基平均相差3%。mtDNA異質性和多態性與疾病的關系受到越來越多的關注。(4)mtDNA基因排列緊湊，除與其復制及轉錄有關的一小段區域外，內含子序列極少，因此其DNA序列利用效率高。一旦mtDNA發生突變，往往容易累及其基因組的一些重要功能區域，導致嚴重后果。(5)mtDNA懸掛在線粒體內膜上，與氧化磷酸化和活性氧生成的主要場所相距較近，極易受到活性氧和自由基攻擊。同時，mtDNA復制錯誤率高且修復機制不完善，部分突變還具有疊加效應。

2 mtDNA穩定性調節

mtDNA穩定性受多種因素影響，不穩定的mtDNA可能來自mtDNA本身或繼發于nDNA異常，這種異常在mtDNA的復制和轉錄、損傷和修復以及線粒體動力學上都有所體現。

2.1 mtDNA復制和轉錄正確有效的復制是維持mtDNA穩定性的先決條件。mtDNA復制通常采用兩條鏈非同步復制的鏈置換模型，復制速度快，且可以連續進行。mtDNA也可通過與nDNA類似的雙鏈配對模型，此時細胞mtDNA可出現暫時性減少。

研究證實與mtDNA復制機制有關的因子均為nDNA編碼蛋白，其功能障礙可影響mtDNA復制，導致mtDNA突變或含量降低。γ聚合酶是mtDNA復制的關鍵因子，其催化亞基(mitochondrial DNA polymerase gamma 1，POLG1)突變可導致錯誤核苷酸摻入mtDNA，引起呼吸鏈功能障礙，是人類線粒體疾病的一個重要原因。線粒體內的脫氧核糖核苷三磷酸池(deoxyribonucleotide triphosphate pool，dNTP池)對于復制的保真度有重要作用。其中線粒體dNTP池調節因子，如線粒體脫氧核糖核苷酶可能在調節mtDNA復制中發揮重要作用。

mtDNA復制的起始需要由輕鏈啟動子起始轉錄一小段RNA作為引物，因此正常的轉錄機制是mtDNA正常復制的先決條件。線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A，mtFFA)和線粒體轉錄因子B(mitochondrial transcription factor B，mtFFB)是重要的mtDNA轉錄因子，如無轉錄因子存在，mtRNA聚合酶則不能識別線粒體轉錄啟動子，而僅有極弱的非特異性轉錄活性。資料顯示這2種因子是哺乳動物線粒體類核的主要組成部分，可以調節線粒體轉錄和復制，且在維持mtDNA拷貝數和線粒體形態中起重要作用。mtFFA基因敲除的純合子小鼠在胚胎期即可死亡，雜合子小鼠則表現為mtDNA拷貝數減少和心臟線粒體呼吸功能障礙［2］。若抑制多巴胺能神經元中mtFFA的表達還可引起mtDNA含量降低和線粒體呼吸功能嚴重障礙而導致多巴胺細胞死亡從而引起神經退行性病變［3］。

2.2 mtDNA損傷與修復mtDNA損傷修復與細胞凋亡、衰老關系十分密切。自Hunter和Haworth發現線粒體滲透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)存在后，目前認為mPTP的高通透狀態與細胞的死亡有關［4］。該通道主要的2個組成分別是位于線粒體內膜的腺嘌呤核苷酸轉運體(adenine nucleotide transporter，ANT)和位于線粒體外膜的線粒體電壓依賴性陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)，這兩者的開放狀態都與mtDNA的突變損傷有關，其中VDAC的開放狀態還對維持線粒體膜電勢和線粒體內鈣［Ca2+］非常重要。另一方面，線粒體是細胞內ROS產生的主要場所，mtDNA持續暴露在線粒體ROS和自由基中，極易發生氧化修飾和mtDNA突變，因此需要有效的修復系統來維持線粒體基因組的完整與穩定。

以往認為mtDNA缺乏修復機制，近來研究發現，mtDNA可通過堿基切除修復和核苷酸切除修復2個主要途徑進行修復。堿基切除修復途徑是主要的DNA修復機制，通過DNA糖基化酶裂解堿基與DNA糖-磷酸骨架之間的糖苷鍵，切除損傷的堿基［5］，可修復氧化損傷、烷基化、脫氨、位點的缺失和單鏈斷裂等DNA損傷。核苷酸切除修復途徑則通過核酸酶消耗ATP，切除損傷的核苷酸堿基，可識別和處理各種螺旋扭曲病變，如紫外線引起的光化環丁烷嘧啶二聚體和嘧啶6-4嘧啶酮光產物，還可修復較大的或其它修復系統不易修復的DNA損傷。

另外，mtDNA復制和修復還依賴于dNTP池的平衡［6］，因此mtDNA的穩定性受到dNTP代謝過程影響。ANT是心肌線粒體內膜上含量最豐富和最主要的信號轉導蛋白。已知人類ANT蛋白存在4個異構體，它們以組織特異性的方式在不同的位置表達，其與人類線粒體疾病相似。ANT1基因敲除小鼠出現線粒體腦肌病，H2O2生成增加，mtDNA損傷且含量降低，線粒體氧化磷酸化功能降低，可能由于線粒體ANT1缺乏時ROS生成增多而加重mtDNA損傷。而電流假說則認為突變的ANT1從線粒體內膜脫離，可能導致mtDNA損傷并含量降低。

2.3 線粒體動力學異常線粒體是一種處于高度運動狀態的細胞器，頻繁出現分裂和融合，這種過程被稱為線粒體動力學。因此線粒體的形態結構并不是固定不變的，其分裂和融合的平衡對于線粒體形態維持以及能量代謝、細胞凋亡、信號轉導等功能實現有重要意義。當線粒體動力學改變以及mtDNA損傷或突變時，可通過與健康線粒體融合，進行重組和修復。各種原因造成的線粒體融合-分裂失衡，均可導致細胞凋亡、mtDNA減少、突變和線粒體呼吸功能嚴重障礙［7］。

線粒體的融合裝置是一個約800 kD的大型蛋白復合物，主要由線粒體融合蛋白(mitofusin，Mfn)和視神經萎縮1型蛋白(optic atrophy type 1，OPA1)組成。OPA1存在于線粒體內膜，是一個含有960個氨基酸殘基的蛋白質，屬于一個高度保守的GTP酶相關的動力家族。OPA1的GTP酶活性的降低可能通過影響線粒體dNTP池而影響mtDNA穩定性，其含量減少可導致線粒體組織結構異常、線粒體呼吸功能降低、mtDNA缺失以及ROS生成增加。Mfn1和Mfn2是存在于線粒體外膜的蛋白質，每個蛋白由1個大的GTP酶域和2個七肽重復序列組成。它們的基因突變或表達抑制可導致線粒體呈碎片狀改變，呼吸功能障礙，mtDNA大量缺失，表明線粒體融合-分裂過程參與維持mtDNA穩定［8］。另外，Mfn2突變或表達降低還可延緩氧化損傷后mtDNA的修復過程。

3 線粒體DNA穩定性相關疾病

3.1 視神經病變OPA1在視網膜中表達量非常豐富，其基因突變可以導致線粒體腦肌病綜合征，表現為感覺神經性耳聾、共濟失調、神經軸突的感覺運動多發性神經病變、慢性進行性眼外肌麻痹和常染色體顯性遺傳性視神經萎縮(autosomal dominant optic atrophy，ADOA)。ADOA1型是一個嚴重的線粒體視神經病變，其特點是視網膜神經節細胞自嬰幼兒時期即開始不可逆損失，從而導致進行性視力下降甚至失明［9］，對中國、日本、丹麥和波蘭的家系調查均發現，OPA1基因雜合突變可能是ADOA發生的關鍵性致病因素。

Mfn2和ANT1突變也可能與視神經病變發生相關。Rouzier等［10］調查了一個嬰幼兒期開始視神經萎縮的家族，其臨床表現與ADOA“+”表型相關的OPA1突變類似，而且與一個新的Mfn2錯義突變相關。該突變引起患者骨骼肌mtDNA大量缺失，可能參與了常染色體顯性遺傳形式的進行性眼外肌麻痹的發生與發展。

3.2 癌癥多種類型癌癥患者的癌變組織和非癌變組織出現mtDNA突變，提示mtDNA缺陷在癌癥的發生、發展中具有重要作用。目前認為，POLG基因突變可導致mtDNA缺失及乳腺癌表型，POLG的CAG重復變異可增加未成年婦女患乳腺癌的風險，但POLG-CAG重復序列長度是否為乳腺癌的潛在危險因素還需要進行大樣本量研究加以驗證［11］。而在垂體腺瘤的研究中，mtDNA突變導致呼吸鏈復合體Ⅰ的突變卻被證明具有抗腫瘤作用，這種呼吸鏈復合體Ⅰ的突變很有可能是腫瘤發生的個體修飾［12］。另外，大腸癌的發生可能與高頻率的TFAM截短突變有關，表現為TFAM蛋白質水平降低和mtDNA耗竭［13］。

3.3 心肌病Chen等［7］報道，人類和大鼠心臟衰竭時OPA1降低，導致線粒體組織結構異常，mtDNA耗損，線粒體電子傳遞鏈復合物活性降低。線粒體呼吸功能障礙導致ROS產生增加，累積的ROS反過來又損傷電子傳遞鏈和mtDNA，形成惡性循環，提示OPA1突變誘導的mtDNA損失可能是心臟病進行性發展過程中線粒體功能障礙的關鍵環節。

最近的研究發現，心肌病和肌病的發生與ANT1突變有關。病人的肌肉組織中不能檢測到ANT1表達，同時mtDNA含量降低，線粒體數量增多，異常線粒體大幅增加［14］。動物實驗也證實，ANT1敲除小鼠出現擴張型心肌病，其發生可能與mtDNA損傷和細胞凋亡有關。

3.4 糖尿病肥胖者和2型糖尿病患者骨骼肌Mfn2表達減少，導致mtDNA缺失，線粒體數量和氧化磷酸化功能下降，進而降低肌肉和肝臟組織的胰島素信號，誘導發生胰島素抵抗。因此，Mfn2是胰島素靈敏度調節和糖尿病藥物開發的一個潛在目標［15］。另外，糖尿病患者視網膜mtDNA易受損，導致其轉錄功能障礙。TFAM是mtDNA的轉錄和復制的一個關鍵因子，可改善糖尿病患者線粒體的生物合成，減緩或防止糖尿病性視網膜病變的進展［16］，其甲基化作用可能參與青少年胰島素抵抗的發病機制［17］。

3.5 腓骨肌萎縮腓骨肌萎縮(peroneal muscular atrophy;又稱Charcot-Marie-Tooth disease，CMT)是一組臨床和遺傳異質性的神經肌肉疾病，目前超過30個基因已被報道與CMT有關，其中Mfn2基因點突變是CMT最常見的原因，可引起腓骨肌萎縮2A型疾病(CMT2A)亞型，它是一種常染色體顯性遺傳性神經病變，表現為感覺和運動神經元長軸突功能障礙所致的早期肢端癥狀，以及視神經萎縮、感音神經性耳聾、痙攣性截癱、手指震顫、弓形足、脊柱側彎或膝關節攣縮等，是軸突周圍神經病變的缺陷形式［18］。

3.6 帕金森病帕金森病(Parkinson disease，PD)是黑質中多巴胺能神經元損傷造成的一種常見的神經退行性疾病，線粒體功能障礙累積在其發病機制中起重要作用。研究表明，PD患者黑質體細胞mtDNA存在缺失突變和(或)點突變。Balafkan等［19］發現POLG1基因的CAG重復數與某些人群中的帕金森病有關。POLG是唯一參與mtDNA復制和修復的多聚酶，鑒于POLG1基因突變誘導的點突變積累和mtDNA缺失參與了多種疾病發生，因此POLG1基因突變可能也參與了PD繼發性mtDNA突變積累。Gui等［20］也認為POLG1基因多態性可能參與了中國人群PD的發生，是PD易感性的理想候選基因。

3.7 腦神經疾病線粒體神經胃腸腦病(mitochondrial neurogastrointestinal encephalopathy，MNGIE)是一種常染色體隱性遺傳疾病，部分MNGIE患者的肌肉活檢發現呼吸鏈復合物Ⅰ和Ⅳ酶活性下降、mtDNA耗損、缺失、線粒體形態異常和肝性腦病，表明mtDNA不穩定可能參與了MNGIE的發生。由于MNGIE與PD都伴有中樞神經系統癥狀，都有線粒體結構和功能異常，并且其遺傳基礎可能也是POLG1突變，因此兩者在發病機制上有很多共同點。不同的是MNGIE是由于遺傳基因的缺陷導致的線粒體結構和功能異常，多發生于兒童和青年，而PD是由于神經系統變性而引起的紋狀體多巴胺含量顯著減少而致病的，老年人多見。Roshal等［21］則認為POLG1的A467T/W748S基因型可能出現廣泛的神經系統表現，包括頂枕葉癲癇、偏頭痛、小腦性共濟失調、感覺運動性軸索型神經病、視覺及感知和認知功能的降低等。

4 結語

mtDNA穩定性、線粒體功能和ROS生成互為因果，常是多種疾病發生的重要病理生理基礎。而nDNA編碼了絕大多數的線粒體蛋白和全部的mtDNA復制、轉錄、修復等調節因子，相關的基因突變都可能影響mtDNA穩定性而導致疾病的發生。雖然已知上述調節因子可以影響mtDNA穩定性，從而在疾病的發生中起著重要作用，但其機制尚待進一步研究。

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Stability of mitochondrial DNA and related diseases

HUANG Shan1，GAO Wen-xiang2，GAO Yu-qi2
(1Department of Pathophysiology，Bengbu Medical College，Bengbu 233030，China;2Department of Highland Physiology and Pathophysiology，Faculty of Highland Military Medicine，Key Laboratory of High Altitude Medicine of PLA，Key Laboratory of High Altitude Medicine for Ministry of Education，Third Military Medical University，Chongqing 400038，China.E-mail:winneygaocn@yahoo.com.cn)

Mitochondrion is a semiautonomous organelle，which processes its own genetic material mitochondrial DNA(mtDNA).The stability of mtDNA can be affected by several factors，for example，replication，transcription and translation of mtDNA，mitochondrial fission and fusion.It has been recently found that mtDNA stability-related factors，such as optic atrophy 1(OPA1)，mitofusin 2(MFN2)，aromatic and neutral transporter 1(ANT1)，mitochondrial DNA polymerase gamma 1(POLG1)and mitochondrial transcription factor A(TFAM)，are important for maintenance of mitochondrial function.The stability of mtDNA can be impaired and diseases may occur due to malfunction of the above factors.In this article，we review the study progresses in the regulation of mtDNA stability and its related diseases.

Mitochondria;Mitochondrial DNA;Stability

1000-4718(2014)02-0369-05

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.033

2013-09-10

2013-12-05

國家自然科學基金資助項目(No.NSFC81071610);重慶自然科學基金資助項目(No.CSTC，2010BB5035)

△通訊作者Tel:023-68752335-8208;E-mail:winneygaocn@yahoo.com.cn