蛋白質(zhì)組學技術(shù)在煙草研究中的應用進展

趙鳳霞，高相彬，王正平，李海峰，宋學立，冀敏

1 河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，河南許昌 461000；

2 河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450000；

3 國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190

蛋白質(zhì)組學技術(shù)在煙草研究中的應用進展

趙鳳霞1，高相彬1，王正平1，李海峰2，宋學立1，冀敏3

1 河南省農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，河南許昌 461000；

2 河南工業(yè)大學生物工程學院，河南鄭州 450000；

3 國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190

綜述了蛋白質(zhì)組學作為后基因組時代功能基因組學研究的重要組成部分和前沿研究領(lǐng)域，在煙草研究中的應用進展，探討了煙草根系、葉片等器官的蛋白質(zhì)分離提取方法，蛋白質(zhì)組學在低溫、鹽脅迫和機械損傷等逆境脅迫研究中的應用，煙株應對施肥、紫外線輻射、打頂和病害入侵等環(huán)境變化所發(fā)生的生理、病理反應的內(nèi)在調(diào)控機制研究，以及蛋白質(zhì)組學在提高煙葉品質(zhì)研究中的應用。最后提出了目前煙草蛋白質(zhì)組學研究所面臨的幾個問題，并對下一步的研究和發(fā)展前景進行了展望。

煙草；蛋白質(zhì)組學；脅迫反應；調(diào)控機制

蛋白質(zhì)組（proteome）由蛋白質(zhì)的“Prote”和基因組的“ome”字母拼接而成，指一個基因組或一類細胞、組織表達的所有蛋白質(zhì)的總和[1]，由澳大利亞學者Wilkins和Williams于1994年在意大利的一次電泳會議上首次提出。同基因組相似，蛋白質(zhì)組為復雜發(fā)育過程中同時發(fā)生的蛋白質(zhì)相關(guān)變化提供了重要的高通量研究手段[2]，與基因組相比，蛋白質(zhì)組反映的是直接影響細胞生理生化變化的蛋白質(zhì)。此外，比較RNA的表達水平，蛋白質(zhì)水平整合了轉(zhuǎn)錄后加工和翻譯后加工的過程，而這些過程對細胞中最終產(chǎn)物的數(shù)量、定位和效率都會產(chǎn)生影響[3]。蛋白質(zhì)組學是一項使用日漸廣泛的研究方法，對兩種不同的材料或處理，可以從蛋白質(zhì)表達譜的寬度進行比較研究，揭示其中的內(nèi)在機理。基于信號轉(zhuǎn)導和代謝途徑的上下游網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)組的研究不僅具有高通量的寬度，而且為生命過程的上下游節(jié)點研究提供了良好的機會。蛋白質(zhì)組概念的提出，為科學家對于生命活動規(guī)律的研究開拓了新的領(lǐng)域。進行蛋白質(zhì)組學研究是大勢所趨，也是后基因組時代的重要研究前沿和熱點領(lǐng)域[4]。

蛋白質(zhì)組學的主要研究內(nèi)容為蛋白質(zhì)間的相互作用、翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)在不同部位、不同環(huán)境條件下以及生命過程不同階段的表達等方面[5]，闡明組織、器官或者生物體全部或者部分蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式，揭示特定的生命現(xiàn)象和某些生命過程的內(nèi)在機制，它是在更深層次上探索生命活動的規(guī)律和生理、病理現(xiàn)象。自1997年第一篇植物蛋白質(zhì)組學文章發(fā)表以來,伴隨著蛋白質(zhì)組學技術(shù)體系的不斷完善,植物蛋白質(zhì)組學發(fā)展迅速，多種植物組織(器官)的蛋白質(zhì)表達譜分析相繼完成，植物不同發(fā)育階段的蛋白質(zhì)組變化，以及此過程中植物響應各種環(huán)境因子和逆境脅迫的差異表達蛋白質(zhì)組也被大量報道[6-8]。

煙草是我國重要的經(jīng)濟作物之一，具有悠久的栽培歷史，其生產(chǎn)行業(yè)已經(jīng)成為國民經(jīng)濟的一個重要組分,也是一些地方省市的財政支柱。同時，煙草還是一種重要的模式植物，在植物遺傳、發(fā)育和轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域的研究中具有特殊意義。蛋白質(zhì)雙向電泳、質(zhì)譜、酵母雙雜交系統(tǒng)、蛋白質(zhì)微陣列、支持大規(guī)模數(shù)據(jù)處理的計算機系統(tǒng)和軟件、軟電離以及生物信息學等蛋白質(zhì)組技術(shù)的快速發(fā)展，為煙草蛋白質(zhì)組學研究奠定了堅實的基礎(chǔ)[9]。近年來科研工作者對煙草進行了大量研究，作為一種新興手段，蛋白質(zhì)組學技術(shù)在煙草研究中取得了豐碩的成果。本文對蛋白質(zhì)組學在煙草中的應用相關(guān)研究進展進行了綜述。

1 蛋白質(zhì)提取、分離方法研究

蛋白質(zhì)組學是隨著蛋白質(zhì)研究技術(shù)的快速發(fā)展而發(fā)展起來的。蛋白質(zhì)分離技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究的三大核心技術(shù)之一[10]，其中最常用的分離技術(shù)是蛋白質(zhì)雙向電泳(Two-dimensional electrophoresis，2-DE)，而蛋白質(zhì)的提取和樣品制備對雙向電泳的分辨率和重復性起著舉足輕重的作用[11-13]。目前蛋白質(zhì)的提取方法很多，但由于不同植物具有特異的生理生化特性，蛋白質(zhì)的最適提取方法差異較大，甚至同一植物不同組織(器官)的最適提取方法也不盡相同。采用恰當?shù)奶崛》椒ㄊ谦@得具有良好分離效果2-DE圖譜的前提條件[14]。因此探索煙草不同組織(器官)的高質(zhì)量蛋白質(zhì)提取分離技術(shù)具有迫切的現(xiàn)實意義。

煙草根系既是水分和養(yǎng)分吸收的主要器官，又是煙堿等重要次生代謝物質(zhì)合成的主要場所，與煙株發(fā)育和煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)密切相關(guān)。研究煙草特殊生長環(huán)境下或某個發(fā)育時期根系蛋白質(zhì)的表達情況，對于及時了解煙草生長發(fā)育過程中某些代謝途徑具有重要意義。然而煙草根系中蛋白質(zhì)含量相對較低，并且含有大量的多糖、多酚、蛋白酶、氧化酶、酯類、醛類和其它次生代謝物質(zhì)，為根系蛋白質(zhì)的提取增加了一定的難度。林世鋒等以栽培煙草品種K326生長期根系為材料，對常規(guī)裂解液法、TCA/丙酮沉淀法、Trizol抽提法和酚法等4種總蛋白的提取方法進行了比較[15]，并通過后續(xù)的2-DE對蛋白質(zhì)分離效果進行了檢測。研究結(jié)果表明，Trizol抽提法和酚法能夠有效地抑制蛋白酶活性，防止蛋白降解和高分子量蛋白缺失，其中酚法雖然過程復雜，操作步驟繁瑣，但是該提取方法得到的2-DE圖譜中的分離蛋白數(shù)量較多，雜質(zhì)較少，凝膠圖像條帶清晰，分離效果較好，更適合后續(xù)分析。

煙草是葉用作物，煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)是廣大煙農(nóng)追求的終極目標。煙葉蛋白質(zhì)提取和分離方法的確立為產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。王紹美等[16]以干旱敏感型煙草品種中煙100和易感黑脛病煙草品種小黃金1025為試材，參照Damerval等的方法[17-19]，研究了旺長后期和苗期煙草葉片蛋白質(zhì)樣品的制備方法，并參照Huang[20]和Laemmli[21]等的方法對第一向等電聚焦和第二向聚丙烯酰胺凝膠電泳條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，采用TCA-丙酮沉淀法提取旺長后期煙草葉片蛋白質(zhì)樣品，提取之前進行兩次丙酮預冷，選用pH 4-7 的17cm IPG 預制膠條，上樣170 μL(總上樣量1 mg)，可以得到重復性較好，蛋白質(zhì)點清晰的雙向電泳圖譜；苗期煙草葉片總蛋白質(zhì)樣品通過蛋白質(zhì)分級提取、酚抽提及丙酮洗滌相結(jié)合的方法獲得，選用pH 4-7 的24cm線性IPG 膠條，水化12 h上樣，上樣450 μL(總蛋白量1.5 mg)，可得到背景干凈，蛋白質(zhì)點清晰的雙向電泳圖譜。

蛋白質(zhì)的提取和分離技術(shù)是進行后續(xù)蛋白質(zhì)組學相關(guān)研究的前提和基礎(chǔ)，提取和分離效果直接影響最終的研究結(jié)果。得到煙草各組織(器官)的蛋白質(zhì)提取方法，建立蛋白質(zhì)組研究適用的雙向電泳實驗體系并獲得清晰的雙向電泳圖譜，可以為進一步開展煙草根系、葉片等組織(器官)的蛋白質(zhì)組學研究提供有力的技術(shù)支撐。

2 煙草脅迫蛋白質(zhì)組學研究

煙草在生長發(fā)育過程中會受到各種生物和非生物脅迫，如干旱、洪澇、鹽堿、高溫、低溫、病蟲草害、機械損傷等等，這些逆境條件會對煙草的正常生長發(fā)育產(chǎn)生不利影響，進而導致煙葉產(chǎn)量降低，品質(zhì)下降。蛋白質(zhì)是基因功能的最終執(zhí)行者，是細胞增殖、分化、衰老和凋亡等所有生命活動的直接體現(xiàn)者，它具有表達時間、表達量的差異，而且對外界的環(huán)境刺激可以能動地產(chǎn)生反應，逆境條件下煙草蛋白質(zhì)的種類和表達量發(fā)生顯著改變，形成各種內(nèi)在調(diào)控機制，以適應或者抵御環(huán)境條件的改變。研究煙草脅迫條件下的蛋白質(zhì)組學，為我們更加深入地了解特定條件下煙株應對環(huán)境變化所發(fā)生的生理、病理過程的內(nèi)在機理、信號應答機制以及環(huán)境脅迫和抗逆性之間的關(guān)系提供了一個有力的手段，為全面地掌握抗逆相關(guān)蛋白和基因，系統(tǒng)地分析脅迫造成的煙株傷害機理，充分地了解煙株應對脅迫的反應機制具有重要意義。

鹽脅迫是植物最嚴重的非生物逆境脅迫之一[22]，進行煙草響應鹽脅迫的蛋白質(zhì)組研究，鑒定鹽脅迫反應蛋白并了解其功能，對于通過遺傳學方法改良煙草耐鹽抗逆性具有重要作用。Roya Razavizadeh通過蛋白質(zhì)組學的方法研究了苗期煙草葉片在鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)表達譜的情況[23]。150mM外源NaCl處理的煙草葉片中檢測到205個重復性較好的蛋白點，有18個蛋白點差異表達，這些蛋白質(zhì)的功能涉及光合作用、防御功能、新陳代謝、蛋白質(zhì)的折疊和運輸?shù)确矫妫渲猩险{(diào)表達的蛋白質(zhì)有8個，主要是RuBisCO大亞基和RuBisCO小亞基等光合作用相關(guān)蛋白，而下調(diào)表達的10個蛋白質(zhì)主要是防御和能量代謝相關(guān)蛋白，包括熱休克蛋白、超氧化物歧化酶、三磷酸腺苷等，其中一個70KD基質(zhì)熱休克蛋白表達量顯著下調(diào)。

我國北方林區(qū)主要由混交林和天然林組成。混交林和天然林更新速度直接影響著林業(yè)資源的利用效率。因此，加快混交林和天然林的更新速度，將顯著提高北方林業(yè)資源的利用效率，進而促進北方經(jīng)濟的發(fā)展。加快混交林和天然林更新對促進生態(tài)平衡有積極作用，現(xiàn)階段我國北方混交林和天然林更新速度正在加快。

低溫是限制煙株地理分布和煙葉產(chǎn)量提高的重要環(huán)境因素[24]。煙株受到低溫脅迫后誘導脅迫應答基因表達，合成特殊的蛋白質(zhì)來響應低溫，提高抗寒能力[25]。低溫脅迫對煙株生長發(fā)育和代謝途徑影響的分子機制目前尚不清楚。Jin等采用2-DE和毛細管液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(CapLC-MS/MS analysis)的方法研究了煙草幼苗受到4℃低溫傷害4h以后葉片的蛋白質(zhì)表達情況[26]。101個蛋白點的表達存在顯著差異，其中22個蛋白點只在處理葉片中表達，50個蛋白點只在對照葉片中表達，處理葉片中下調(diào)表達的蛋白點有21個，上調(diào)表達的蛋白點8個。質(zhì)譜鑒定出73個差異表達的蛋白質(zhì)，按功能分為兩大類，一類是調(diào)控類蛋白質(zhì)，主要與信號轉(zhuǎn)導、核酸的加工、翻譯、蛋白質(zhì)的加工等過程相關(guān)，另一類是脅迫類蛋白質(zhì)，主要與氧化還原反應、光合作用、光呼吸、碳氮代謝和能量代謝相關(guān)。與調(diào)控過程相關(guān)的蛋白質(zhì)差異表達表明煙草響應低溫以后存在一系列復雜的調(diào)控機制。葉片受到低溫傷害以后，光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)的表達量明顯降低，說明低溫傷害以后，煙草葉片的光合系統(tǒng)和葉綠體細胞器受到了嚴重損害，這是低溫對煙葉造成傷害的主要原因之一，也很好地解釋了為什么煙草對低溫傷害敏感。另外，植物受到低溫脅迫以后，活性氧作為低溫的信號分子大量產(chǎn)生，這些活性氧會導致正常細胞產(chǎn)生氧化損傷，植物體內(nèi)存在活性氧清除系統(tǒng)，將活性氧維持在正常水平。Jin的研究中得到了過氧化氫酶、硫氧還蛋白過氧化物酶等活性氧清除系統(tǒng)相關(guān)酶類的上調(diào)表達，解釋了低溫導致煙草發(fā)生氧化損傷的調(diào)控機制。

煙草生長發(fā)育過程中會發(fā)生多種病蟲草害，目前對煙草自身抗病機理的研究主要集中在抗病基因定位和分子標記輔助育種[27-29]、基因組學[30-32]和抗性基因的轉(zhuǎn)化[33-35]等方面，針對蛋白質(zhì)水平上煙草抗病機理進行的研究較少。煙草生長過程中可能發(fā)生的毀滅性病害-青枯菌的致病機理是當前植物病理學研究的重要課題之一[36]。宋浩等通過非標記定量蛋白質(zhì)組學的方法，對煙草青枯病的致病性以及病菌侵染煙草后誘導機體的蛋白質(zhì)應答進行了系統(tǒng)性研究[37]。利用蛋白質(zhì)組學鳥槍法技術(shù)，在致病菌株和非致病菌株中分別鑒定出1346和1628個蛋白質(zhì)，對這些差異表達蛋白質(zhì)水平進行評估，得到了它們在功能學上的分類信息，為進一步研究青枯病侵染煙草的生物學和病理學機制提供了一個新的研究思路。崔宏偉等研究了煙草受野火病菌侵染后蛋白質(zhì)表達變化的情況，在蛋白質(zhì)水平上分析了煙草抗野火病機制[38]。其研究共檢測到10個差異蛋白質(zhì)，其中6個下調(diào)表達，4個上調(diào)表達。下調(diào)表達的蛋白質(zhì)主要參與葉片光合作用，他認為煙株受到病菌侵染后，物質(zhì)和能量代謝相關(guān)蛋白表達量下降，光合作用降低；糖代謝相關(guān)蛋白表達量增加，加速了碳循環(huán)，從而提高了煙株抗病能力；氨基酸代謝相關(guān)蛋白表達量也增加，產(chǎn)生更多的氨基酸來修復被病原菌破壞的蛋白質(zhì)，提高煙株抗病性。

紫外線輻射對煙草來講不僅僅是一種脅迫因子，還是香氣風格形成的重要調(diào)控因子[39]，因此紫外線輻射強度的變化會對煙葉品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。陳宗瑜等利用蛋白質(zhì)組學的方法，以云南普栽烤煙品種K326為試材，深入研究了低緯高原種植條件下不同紫外線輻射對烤煙生理代謝和調(diào)控途徑的影響[40]。紫外線照射會產(chǎn)生活性氧，對細胞造成氧化脅迫，煙株防御機制最重要的一條途徑是抗氧化酶的大量表達來清除活性氧，抵御活性氧的毒害作用，維持體內(nèi)平衡，減少傷害。另外，煙株為了修復紫外線照射造成的葉片損傷，提高富含甘氨酸的RNA結(jié)合蛋白表達水平，加速信號傳導過程，降低傷害程度。

氮素對煙株生長發(fā)育和煙葉品質(zhì)形成發(fā)揮著舉足輕重的作用，氮素營養(yǎng)一直是烤煙栽培研究中的熱點問題。施肥時間、施氮水平和氮素形態(tài)等均會造成煙葉中蛋白質(zhì)表達和調(diào)控的差異，進而影響煙堿合成等重要代謝過程。梁景霞以翠碧一號煙草為試材，采用比較蛋白質(zhì)組學的方法對低氮與高氮兩種供氮水平下的煙草根系蛋白、葉片蛋白進行了系統(tǒng)分析[41]，在蛋白質(zhì)水平上較為準確和直觀地了解了煙草根系、葉片在低氮脅迫下蛋白質(zhì)表達的種類及豐度變化。研究結(jié)果共鑒定出21個差異表達蛋白質(zhì)，涉及蛋白質(zhì)代謝和降解、碳代謝、抗性與環(huán)境互作、光合反應、信號轉(zhuǎn)導等不同的功能組群，從而在蛋白表達水平上更深入地解析了煙草對低氮環(huán)境的多代謝途徑響應機制。

目前關(guān)于植物響應機械損傷蛋白質(zhì)組學的分析報道較少。烤煙生產(chǎn)上通過打頂，去除頂端生長優(yōu)勢，不僅影響根尖煙堿合成等重要代謝途徑，對煙葉也會產(chǎn)生多方面的調(diào)節(jié)和影響。楊惠娟等應用2-DE對打頂前后葉片蛋白質(zhì)表達的差異變化進行了研究[42]，經(jīng)過進一步的質(zhì)譜鑒定和生物信息學分析，鑒定出了9個蛋白質(zhì)在打頂前后10天的葉片中差異表達。其中上調(diào)表達的蛋白有4個，主要是光合作用中的光反應相關(guān)蛋白，即葉綠體放氧復合蛋白、Atfkbp13、PsbP 家族蛋白，另外一個與植物抗病性相關(guān)(β-1，3-葡聚糖酶前體蛋白)，下調(diào)表達的蛋白質(zhì)分別是SHM1、SHM2、乙醇酸氧化酶、葉綠體核糖體蛋白L1和60S 核糖體蛋白，主要涉及光呼吸和煙株的生長發(fā)育、細胞分裂等方面。這些蛋白質(zhì)表達的差異表明，煙株打頂可以在蛋白質(zhì)水平上增強煙草葉片的光合作用，提高葉片的抗性，同時降低葉片的能量代謝，調(diào)節(jié)煙葉生長。

3 煙葉品質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)組學研究

煙葉品質(zhì)好壞不僅直接影響煙草產(chǎn)品的質(zhì)量和效益，而且對煙草經(jīng)濟的發(fā)展起著舉足輕重的作用。國內(nèi)外科研工作者通過分子生物學的方法對煙葉的香氣風格以及煙堿等有害物質(zhì)的代謝調(diào)控進行了大量研究。目前有關(guān)蛋白質(zhì)組學在這方面的研究并不多見。

蔡永占利用比較蛋白質(zhì)組學的方法，對云南省的昆明市和麗江市兩個不同氣候環(huán)境的生態(tài)試驗點團棵期烤煙品種云煙87的葉片蛋白質(zhì)表達情況進行了研究[46]，鑒定出33個差異表達的蛋白質(zhì)，防御/抗脅迫、蛋白質(zhì)合成，礦質(zhì)代謝相關(guān)的差異蛋白在昆明點的煙草葉片中表達較高，增強光合效率相關(guān)的蛋白質(zhì)在麗江點的煙草葉片中表達較高。該結(jié)果與昆明點平均降水量顯著低于麗江點的氣候特點一致，說明昆明點的煙草為了適應干旱的環(huán)境條件，合成較多的防御/抗脅迫相關(guān)蛋白來調(diào)適各種代謝途徑，加強礦質(zhì)代謝，維持煙株的正常生長發(fā)育。該研究結(jié)果在蛋白質(zhì)表達水平揭示了團棵期煙草對不同氣候環(huán)境響應的分子機理。

煙堿是煙草根系合成的重要次生代謝物質(zhì)，其含量高低是評價煙葉品質(zhì)的重要指標之一，如何在不影響煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)和煙農(nóng)利益的前提下降低中上部煙葉煙堿含量是煙草行業(yè)迫切需要解決的問題。煙堿的合成和積累過程存在一個異常復雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控體系，有關(guān)煙堿合成和調(diào)控的研究一直是次生代謝研究領(lǐng)域的焦點之一。煙草科研工作者對煙堿生物合成的分子調(diào)控進行了大量研究[47-48]，但是關(guān)于其蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)機制的研究鮮有報道。為了深入了解打頂對煙堿合成的影響，Liu等通過2-DE對打頂前后烤煙根尖差異表達的蛋白質(zhì)進行了分析鑒定[50]，得到4個與煙堿代謝相關(guān)的差異蛋白質(zhì)，其中氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶、精胺/亞精胺合成酶和內(nèi)含子成熟酶(mature enzyme K)表達量上調(diào)， 6-磷酸山梨醇脫氫酶（S6PDH）表達量下調(diào)。煙堿的生物合成和氮素代謝密切相關(guān)，而氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶催化氨甲酰磷酸的形成，該過程不但為核苷酸的合成提供氨基，同時為氨基酸的生物合成提供氨基，在氮素代謝過程中起著非常重要的作用。精胺/亞精胺對煙堿代謝具有正調(diào)控作用，其含量增加有利于煙堿的生物合成。內(nèi)含子成熟酶與翻譯水平上的基因表達直接相關(guān)，打頂以后，內(nèi)含子成熟酶通過影響碳氮代謝相關(guān)酶基因表達水平的變化，進而促進煙堿的生物合成。總體來講，打頂導致煙株原始庫源關(guān)系發(fā)生改變[51]，上述差異蛋白質(zhì)表達水平的變化，均促進氮代謝向煙堿合成的方向進行。

王茂等為了探索打頂對煙堿合成的影響以及茉莉酸信號途徑在煙堿合成過程中的作用，通過茉莉酸處理模擬煙草打頂，采用差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)對烤煙根尖組織細胞蛋白質(zhì)組進行了分析[52]。結(jié)果表明，打頂和茉莉酸處理后，S6PDH表達量下調(diào)，可能導致其調(diào)控產(chǎn)物蔗糖-6-磷酸（S6P）含量降低，S6P對蔗糖磷酸合成酶（SPS）的抑制作用降低，從而導致煙株根系蔗糖產(chǎn)生量增加，這不僅為煙堿合成提供碳骨架和能量，還有可能促進煙堿合成相關(guān)基因的表達。3-磷酸甘油醛脫氫酶（G3PDH）表達量下調(diào)，表明會有大量3-磷酸甘油醛積累，用于煙堿的生物合成。同打頂處理的結(jié)果一致，茉莉酸處理后氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶和精胺/亞精胺合成酶表達量上調(diào)，它們在氮代謝過程中發(fā)揮重要作用。

普通煙草葉片表面著生大量毛狀體，這些毛狀體對煙葉品質(zhì)有重要影響[53]，它們分泌大量次生代謝物質(zhì)，與煙葉化學成分、香吃味和抗蟲性關(guān)系密切[54-58]。目前人們對煙葉表面毛狀體的代謝途徑了解較少，van Cutsem等為了研究它們在提高煙葉品質(zhì)及增強抗性方面的作用，通過冰凍研磨獲得了絨毛狀煙草葉表毛狀體，然后利用2-DE結(jié)合MALDI-TOFMS-MS二級質(zhì)譜（基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜）和高效液相色譜串聯(lián)二級質(zhì)譜兩種方法分別獲得了1373和858個蛋白點[59]。經(jīng)過進一步研究，鑒定出這些蛋白質(zhì)的功能主要涉及次生代謝、（非）生物脅迫反應和初生代謝三個方面。次生代謝相關(guān)蛋白質(zhì)主要是與萜類代謝有關(guān)的酶類，這也是van Cutsem鑒定出的最主要的一類蛋白質(zhì)。異戊烯基二磷酸和烯丙基二磷酸通過甲羥戊酸(MVA)途徑形成倍半萜和三萜，通過類萜合成代謝（MEP）途徑形成單萜和二萜。MEP途徑所需要的七個酶在van Cutsem的研究中全部被鑒定出，催化該反應最后一步的1-羥基-2-甲基-2-丁烯基-4-磷酸還原酶是表達量最高的蛋白質(zhì)之一，從而很好地解釋了煙草毛狀體含有豐富的類異戊二烯前體物質(zhì)；鑒定出的萜類代謝相關(guān)蛋白質(zhì)還包括異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶、牛兒基二磷酸合酶和環(huán)化酶等。鑒定得到的非生物脅迫反應相關(guān)蛋白質(zhì)主要包括植物解毒相關(guān)酶類，如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，它將細胞內(nèi)毒性分子與谷胱甘肽結(jié)合，然后將結(jié)合產(chǎn)物送入液泡，在異生物質(zhì)的脫毒過程發(fā)揮作用，同時它還在植物對病原入侵的超敏反應過程中發(fā)揮作用，病原入侵后植物體爆發(fā)大量H2O2等活性氧來抵御病原菌的侵害，H2O2會誘導谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的表達，以此來保護細胞內(nèi)DNA和脂肪免受氧化脅迫的損傷；非生物脅迫反應相關(guān)蛋白質(zhì)還包括超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶、硫氧還蛋白過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶等，它們在抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)等活性氧清除過程中發(fā)揮作用，保護細胞免受活性氧的傷害；生物脅迫反應相關(guān)蛋白質(zhì)主要包括幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等，說明毛狀體作為煙葉的“第一線”，的確在防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用；van Cutsem的研究還鑒定得到了最近在煙草上剛剛發(fā)現(xiàn)的一個新的蛋白質(zhì)phylloplanins，它可以抑制孢子萌發(fā)，在感病早期防止病原菌入侵。該研究鑒定出的初生代謝相關(guān)蛋白質(zhì)中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和果糖-1,6-二磷酸酶這兩種酶主要存在于糖異生途徑中，可能為蔗糖酯的合成提供碳水化合物；類酯代謝相關(guān)蛋白質(zhì)與蠟質(zhì)的形成有關(guān)；氨基酸代謝相關(guān)酶類主要參與S-腺苷蛋氨酸循環(huán)和支鏈氨基酸的代謝過程。

4 小結(jié)

隨著越來越多的生物全基因組測序工作的完成，蛋白質(zhì)組學技術(shù)得到了突飛猛進的發(fā)展，為進一步揭示生物體生長發(fā)育及響應外界環(huán)境因子的關(guān)鍵代謝途徑的分子機制提供了蛋白質(zhì)組水平的證據(jù)，更加貼近了人們對生命現(xiàn)象和生命活動本質(zhì)的認識。煙草科研工作者利用該技術(shù)，在煙株不同組織(器官)發(fā)生的特殊生理生化變化的內(nèi)在機制以及抵御脅迫反應的分子基礎(chǔ)等方面取得了豐碩的研究成果，具備廣闊的發(fā)展前景。但仍存在不足之處，主要表現(xiàn)在：

首先，蛋白質(zhì)組學研究中，蛋白質(zhì)的分離主要通過2-DE來實現(xiàn)，但是2-DE存在某些技術(shù)性的挑戰(zhàn)，比如蛋白樣品制備效率偏低，特別是疏水性膜蛋白提取比較困難，一些低豐度蛋白在制備過程中可能會丟失，多種可能具有重要功能的痕量調(diào)控蛋白很難分離；強堿性等蛋白質(zhì)的分離存在一定困難，選用窄范圍的膠條水合上樣容易產(chǎn)生背景橫紋，影響進一步檢測結(jié)果的準確性。尤其對于煙草來講，由于其特殊的生物學特性，導致煙草根系中蛋白質(zhì)含量相對較低，同時富含多糖、多酚以及多種酶類、酯類、醛類和其它次生代謝物質(zhì)，因而根系蛋白質(zhì)的提取相對比較困難。

第二，煙草蛋白質(zhì)組學主要側(cè)重的是對組織(器官)生長發(fā)育過程和響應脅迫的蛋白質(zhì)表達特征的研究，對蛋白質(zhì)功能、蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì)互作等方面的研究較少；由于低豐度和膜蛋白的分離鑒定比較困難，對亞細胞蛋白質(zhì)組學的研究較少，葉綠體等作為煙草葉片最重要的細胞器，其在代謝活動等生命過程中的意義尚未充分揭示。

第三，目前煙草蛋白質(zhì)組學的檢測技術(shù)一般都是質(zhì)譜等非定量檢測，對于定量研究煙草組織(器官)蛋白質(zhì)表達的正調(diào)控或負調(diào)控報道較少。

針對上述問題，筆者認為下一步煙草蛋白質(zhì)組學研究工作應該重點在以下幾個方面進行：

煙株內(nèi)蛋白質(zhì)間密切互作，通過復雜的信息傳遞形成網(wǎng)絡(luò)體系，影響煙株生長發(fā)育和代謝過程。將煙草蛋白質(zhì)組學技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學、生理組學和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有機結(jié)合，使煙株的生理表現(xiàn)與基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白、代謝等層面上的分析相結(jié)合，將更有利于發(fā)揮蛋白質(zhì)組學技術(shù)在生命現(xiàn)象研究中的樞紐作用，進一步明確基因調(diào)控與蛋白質(zhì)表達的關(guān)系，明確煙堿等次生代謝物質(zhì)的合成途徑、煙株抗逆的深層機理，為相關(guān)理論研究和育種工作作出更大貢獻。

加強對蛋白質(zhì)功能方面的研究，運用功能基因組學、生化反應等手段進一步證實新蛋白質(zhì)在煙株生長發(fā)育過程中以及特殊環(huán)境條件下的功能。比如在基因組學充分發(fā)展的基礎(chǔ)上，進一步探索未知功能的蛋白結(jié)構(gòu)，深入研究結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性，探索蛋白的未知功能，揭示目標蛋白在信號轉(zhuǎn)導途徑中的地位及作用機理；把DNA微陣列與蛋白質(zhì)組學分析相結(jié)合，進一步確定基因調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平進行還是在翻譯水平或者蛋白質(zhì)積累水平進行，更深入地研究基因功能；加強對煙草亞細胞(細胞器)蛋白質(zhì)組進行研究，建立相應的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，有利于進一步研究蛋白質(zhì)的差異表達、功能、定位和翻譯后的修飾，有助于迅速確定優(yōu)良表現(xiàn)型的性狀基因，推進品種改良，加快煙草育種步伐。

在充分利用現(xiàn)有方法和技術(shù)的基礎(chǔ)上，煙草蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，將會在進一步揭示基因組功能和結(jié)構(gòu)，闡明煙草生長發(fā)育、代謝調(diào)控和進化規(guī)律等各生命活動機理方面取得重大突破。

[1]Was inger V C,Cordwell S J,Cerpa-Poljak A,et al.Progress with gene-product mapping of the moll icutes:Myco plasma geni talium[J].Electrophoresis,l995,l6(1):1090-1094.

[2]Cánovas F M,Dumas-Gaudot E,Recorbet G,et al.Plant proteome analysis[J].Proteomics,2004,4:285–298.

[3]Faurobert M,Mihr C,Bertin N,et al.Major proteome variations associated with cherry tomato pericarp development and ripening[J].Plant Physiol,2007,143:1327-1346.

[4]王紹美.煙草基因組學研究方法篇：5.煙草蛋白質(zhì)組學研究方法和應用[J].中國煙草科學,2011,32(5):99-101.

[5]喻娟娟,戴紹軍.植物蛋白質(zhì)組學研究若干重要進展[J].植物學報,2009,44 (4):410-425.

[6]Pineda M,Sajnani C,Barón M.Changes induced by the Pepper mild mottle tobam ovirus on the chloroplast proteome of Nicot iana benthamiana[J].Photo synth Res,2010,103:31-45.

[7]Razavizadeh R,Ehsanpour A A,Ahsan N,et al.Proteome analysis of tobacco leaves under salt stress[J].Peptides,2009,30:1651-1659.

[8]Dani V,Simon W J,Duranti M,et al.Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress[J].Proteomics,2005,5:737-745.

[9]阮松林,馬華升,王世恒,等.植物蛋白質(zhì)組學研究進展Ⅱ蛋白質(zhì)組技術(shù)在植物生物學研究中的應用[J].遺傳,2006,28(12):1633-1648.

[10]van Wijk K J.Challenges and prospects of plant proteomics[J].Plant Physiology,2001,126(2):501-508.

[11]Rabilloud T.Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics:old,old fashioned,but it still climbs up the mountains[J].Proteomics,2002,2:3-10.

[12]Carpentier SC,Witters E,Laukens K,et al.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues:an evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis[J].Proteomics,2005,5(10):2497-2507.

[13]劉偉霞,潘映紅.適用于小麥葉片蛋白質(zhì)組分析的樣品制備方法[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2007,40(10):2169-2176.

[14]F ountoulakis M.Proteomics:current technologies and applications in neurological disorders and toxicology[J].Amino Acids,2001,21(4):363-381.

[15]林世鋒,張 拓,史躍偉,等.煙草根系蛋白質(zhì)雙向電泳樣品制備方法的比較[J].貴州農(nóng)業(yè)科學,2012,40(8):71-74.

[16]王紹美,羅成剛,劉貫山,等.煙草葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳實驗體系的建立[J].中國煙草科學,2012,33(6):54-60.

[17]Damerval C,de Vienne D,Zivy M,et al.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat-seeding proteins[J].Eletrophoresis,1986,7:52-54.

[18]Giavalisco P,Nordhoff E,Lehrach H,et al.Extraction of proteins from plant tissues for two-dimensional electrophoresis analysis [J].Electrophoresis,2003,24:207-216.

[19]Cui Suxia,Huang Fang,Wang Jie,et al.A proteomic analysis of cold stress responses in rice seedlings[J].Proteomics,2005,5(12):3162-3172.

[20]Huang Fang,Parmryd I,Nilsson F,et al.Proteomics of Synechocystis sp.strain PCC 6803:identi fication of plasma membrane proteins[J].Mol Cell Proteomics,2002,1(12):956-966.

[21]Laemmli U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,227:680-685.

[22]Banza i T,Heshokovits G,Katcoff D J,et al.Identi fication and characterization of mRNA transcript differentially expressed in response to high salinity by means of differential display in the mangrove,Bruguera gynorrhiza[J].Plant Science,2002,162:499-505.

[23]Razavizadeh R,Ehsanpour A A,Ahsan N,et al.Proteome analysis of tobacco leaves under salt stress[J].Peptides,2009,30:1651-1659.

[24]陳衛(wèi)國,李永亮,周冀衡,等.烤煙品種耐寒性及相關(guān)生理指標的研究[J].中國煙草科學,2008,29(3):39-42.

[25]郭子武,李憲利,高東升,等.植物低溫脅迫響應的生化與分子生物學機制研究進展[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報,2004,12(2):54-57.

[26]Jin Yan,Zhang Caohao,Yang Hui,et al.Proteomic analysis of cold stress responses in tobacco seedlings[J].African Journal of Biotechnology,2011,10(82):18991-19004.

[27]劉艷華,牟建民,王志德,等.分子標記技術(shù)在煙草遺傳育種中的應用[J].植物遺傳資源學報,2007,8(1):118-122.

[28]Miao Lixiang,Shou Senyan,Cai Jiayan,et al.Identi fication of two AFLP markers linked to bacterial wilt resistance in tomato and conversion to SCAR markers[J].Melecular Biology Reports,2009,36(3):479-486.

[29]徐秀紅,王洪剛,王元英.分子標記技術(shù)在煙草抗病蟲害研究中的應用進展[J].中國煙草學報,2004,10(6):33-38.

[30]Kawasaki T,Nagata S,Fujiwara,et al.Genomic characterization of the filamentous integrative bacteriophages RSSl and RSMI,which infect Ralstonia solanacearum[J].Journal of Bacteriology,2007,189(16):5792-5802.

[31]Poueymiro M,Cunnac S,Barberis P,et al.Two type Ⅲsecretion system effectors from Ralstonia solanacearum GMI1000 determine host-range specificity on tobacco[J].Molecular Plant Mirobe Interactions,2009,22(5):538-550.

[32]Lykidis A,Pérez-Pantoja D,Ledger T,et al.The complete multipartite genome sequence of Cupriavidus necator JMP134,a versatile pollutant degrader[J].PLoS One,2010,5(3):1-13.

[33]Zhang Hongbo,Yang Yuhong,Zhang Zhijin.Expression of the ethylene response factor gene TSRF1 enhances abscisic acid responses during seedling development in tobacco[J].Planta,2008,228(5):777-787.

[34]Zhou Jinxin,Zhang Hongbo,Yang Yuhong,et al.Abacisic acid regulates TSRFL-mediated resistance to Ralstonia solanacearum by modifying the expression of GCC boxcontaining genes in tobacco[J].Journal of Experimental Botany,2008,59(3):645-652.

[35]Zhang Gaiyun,Chen Ming,Li Lianchen,et al.Overexpression of the soybean GmERF3 gene,an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt,drought,and diseases in transgenic tobacco[J].Journal of Experimental Botany,2009,60(13):3781-3796.

[36]林尤劍,顧鋼,陳順輝.作物青枯病防治研究的現(xiàn)狀與對策[J].福建農(nóng)林大學學報:自然科學版,2005,34(3):297-303.

[37]宋浩,沙偉,丁偉,等.非標記定量蛋白質(zhì)組學在煙草青枯菌致病性研究中的應用[J].分子植物育種,2010,8(3):595-604.

[38]崔宏偉,孫劍萍,劉春燕,等.煙草葉片接種野火病菌后蛋白質(zhì)表達差異[J].植物保護,2012,38(6):7-11.

[39]黃勇,周翼衡,鄭明,等.UV-B 對煙草生長發(fā)育及次生代謝的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學報,2009,17(1):140-144.

[40]陳宗瑜,畢婷,吳瀟瀟.濾減UV-B 輻射對烤煙蛋白質(zhì)組變化的影響[J].生態(tài)學雜志,2012,31(5):1129-1135.

[41]梁景霞.煙草種質(zhì)ISSR 標記及對氮素響應的生理遺傳與差異蛋白質(zhì)組學研究[D].福州:福建農(nóng)林大學,2008.

[42]楊惠娟,許俐,王景,等.打頂前后烤煙葉片蛋白質(zhì)表達差異的研究[J].中國煙草學報,2012,18(5):73-78.

[43]周冀衡,楊虹琦,林桂華,等.不同烤煙產(chǎn)區(qū)煙葉中主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學學報:自然科學版,2004,30 (1):20- 23.

[44]唐遠駒.試論特色煙葉的形成和開發(fā)[J].中國煙草科學,2004,25(1):10-13.

[45]崔紅,冀浩,張 華,等.不同生態(tài)區(qū)煙草葉片蛋白質(zhì)組學的比較[J].生態(tài)學報,2008,28(10):4874-4880.

[46]蔡永占,周普雄,李佛琳,等.不同氣候環(huán)境中團棵期煙草葉片蛋白質(zhì)組學分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2013,46(4):859-870.

[47]Katoh A,Hashimoto T.Molecular biology of pyridine nucleotide and nicotine biosynthesis[J].Frontiers in Bioscience,2004,9:1577-1586.

[48]Kidd S K,Melillo A A,Lu R H,et al.The A and B loci in tobacco regulate a network of stress response genes,few of which are associated with nicotine biosynthesis[J].Plant Molecular Biology,2006,60:699-716.

[49]Katoh A,Shoji T,Hashimoto T.Molecular cloning of n-methyl putrescine oxidase from tobacco[J].Plant Cell Physiol,2007,48(3):550-554.

[50]Liu Weiqun,Guo Hongxiang and Li Hao.Proteomics identification of differentially expressed proteins relevant for nicotine synthesis in flue-cured tobacco roots before and after decapitation[J].Agricultural Sciences in China,2008,7(9):1084-1090.

[51]楊懷玉，李春儉.頂端調(diào)控對烤煙生長、主要礦質(zhì)養(yǎng)分吸收和分配特性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2006,39(9):1846-1852.

[52]王茂,張翀,劉衛(wèi)群.茉莉酸處理烤煙打頂誘導煙堿合成調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)的篩選[J].河南農(nóng)業(yè)大學學報,2009,43(3):236-240.

[53]王寶華,吳幗英,黃靜勛.煙葉植物學特性觀察Ⅰ烤煙煙葉腺毛密度及其煙葉品質(zhì)和化學成分的關(guān)系[J].中國煙草,1983,(2):1-6.

[54]Ranger C M,Hower A A.Glandular morphology from a perenn ial alfalfa clone resistant to the potato leafhopper[J].Crop Science,2001,41:1427-1434.

[55]Gang D R,Wang Jihong,Dudareva N,et al.An investigation of the storage and biosynthesis of phenylpropenes in sweet basil[J].Plant Physiology,2001,125:539-555.

[56]孔光輝,徐照麗,王偉,等.不同肥料對紅花大金元中部葉片腺毛及分泌物積累的影響[J].中國煙草學報,2007,13(4):41-44.

[57]程君奇,王菁菁,周 群,等.白肋煙煙葉腺毛分泌物的遺傳分析[J].中國煙草學報,2011,17(2):18-24.

[58]朱顯靈,潘文杰,陳懿,等.不同氣候條件下煙葉腺毛分泌物主要成分的差異分析[J].煙草科技,2011,1:60-65.

[59]van Cutsem E,Simonart G,Degand H,et al.Gel-based and gel-free proteomic analysis of Nicoti ana tabacum trichomes identi fies proteins involved in secondary metabolism and in the (a)biotic stress response[J].Proteomics,2011,11:440-454.

Research and application of proteomics in tobacco

ZHAO Fengxia1,GAO Xiangbin1,WANG Zhengping1,LI Haifeng2,SONG Xueli1,JI Min3
1 Tobacco Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Xuchang 461000,China;
2 College of Bioengineering,Henan University of Technology,Zhengzhou 450000,China;
3 Patent Examination Cooperation Center of the Pat ent Office,Beijing 100190,China

Proteomics and its application were considered as an important part of research frontier in functional genomics in post-geomic era.The following aspects were investigated such as protein separation and extraction method from tobacco roots and leaves,application of proteomics in stress research under low-temperature,salty and mechanically-damaged environment,regulation mechanism of physiological and pathological reactions when tobacco reponded to fertilization,ultraviolet radiation,decapitation and invasion of diseases，and application of proteomics in improving leaf quality.Issues of critical signi ficance to current tobacco proteomics research were discussed and key research areas and prospects were suggested.

tobacco; proteomics; stress response; regulation mechanism

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.01.019

TS413

A

1004-5708（2014）01-0103-08

河南省博士科研啟動基金項目（無編號）；河南省煙草公司“河南省煙草產(chǎn)品質(zhì)量安全標準制訂” (HYKJ 201112)

趙鳳霞（1982—），女，博士，助理研究員，主要研究方向為煙草生理生化。Tel：0374- 4518006，Email：fxzhao1982@gmail.com

高相彬（1982—），男，博士，助理研究員，主要研究方向為煙草烘烤調(diào)制。Tel：0374- 4518006，Email：xbgao1982@163.com

2013-06-04