骨髓間充質干細胞體外對1型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力的影響

李 靜

(川北醫學院組胚教研室，四川 南充 637007)

1型糖尿病(T1DM)又名胰島素依賴型糖尿病(DM)，是由于胰腺產生胰島素的功能遭到破壞，引起胰島素絕對缺乏，而引起DM。T1DM發病率呈增加趨勢，且患者死亡率和常人相比更高〔1，2〕。近些年來有研究發現，骨髓間充質干細胞對T1DM患者淋巴細胞的增殖能力有抑制作用，對機體具有免疫調節作用〔3,4〕；Selmani等〔5〕發現BMSCs發揮免疫調節作用的主要細胞為CD4+Treg 及CD25+Treg細胞。本文主要探究不同數目的BMSCs體外對T1DM大鼠淋巴細胞增殖能力的影響，期望能為臨床DM的治療提供依據。

1 材料和方法

1.1實驗動物與試劑 清潔級SD大鼠12只(雄雌各半，體重200～250 g)，購自成都中醫藥大學實驗動物中心；RPMI-1640培養基、DMEM-LG培養基、植物血凝素(PHA)、胎牛血清(賽默飛生物化學制品有限公司)；鏈脲佐菌素、絲裂霉素C(美國Sigma公司)，大鼠淋巴細胞分離液、噻唑藍(MTT)溶液、二甲基亞砜(深圳達科為公司)，血糖測試儀(強生公司)。

1.2實驗方法

1.2.1大鼠BMSCs的分離、培養 隨機選取雄鼠和雌鼠各3只，麻醉后將其處死。然后無菌條件下取其雙側脛骨和股骨，用生理鹽水清洗后剪開骨頭兩端，用含10%胎牛血清、1%鏈霉素與1%青霉素的DMEM/F12混合液體沖洗骨髓腔，收集沖洗的液體，將收集的液體40 ml滴入離心管，在離心機上1 500 r/min離心10 min后收集沉淀細胞于塑料培養瓶中，將培養瓶放于37℃、5%CO2的濕度培養箱中進行培養。3 d后更換培養液，以后每隔2 d進行換液并棄去未貼壁細胞，傳代3次，留取第3代備用。

1.2.2T1DM大鼠模型的建立、淋巴細胞的制備 剩余的3只雄鼠和3只雌鼠在標準環境下飼養1 w后，連續5 d分別在腹腔注射1%的鏈脲佐菌素(50 mg/kg，1次/d)，每周末測定其尾靜脈空腹血糖，若大鼠的尾靜脈空腹血糖大于16.7 mmol/L，且觀察2 w后血糖無明顯波動，則說明T1DM大鼠模型建立。模型建立成功后，將6只大鼠麻醉后處死，分別在無菌條件下取出大鼠脾臟，用剪刀將脾臟剪碎，將碎片加入分離液中分離淋巴細胞，放入RPMI-1640培養基(含20%胎牛血清)上，利用細胞計數儀將淋巴細胞濃度調整至1×108個/ml。

1.2.3BMSCs與淋巴細胞共培養 實驗分為：A組(1 ml淋巴細胞)、B組(1 ml淋巴細胞+100 μl PHA)、C組(1 ml淋巴細胞+1×106BMSCs+100 μl PHA)、D組(1 ml淋巴細胞+1×105BMSCs+100 μl PHA)、E組(1 ml淋巴細胞+1×104BMSCs+100 μl PHA)，每組5孔，分別按照分組濃度將相應的淋巴細胞、BMSCs和PHA滴入孔板中，取樣結束后將孔板置于37℃，5% CO2濕度培養箱中培養，3 d后進行實驗。

1.2.4淋巴細胞增殖能力的檢測 淋巴細胞增殖能力主要采用MTT比色法檢測：上述淋巴細胞與BMSCs共培養3 d后，選取五組5孔中的3孔，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續培養4 h后小心吸去孔內培養液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光值，3孔的吸光值平均值即為每組的平均吸光值。

1.2.5淋巴細胞細胞周期及凋亡檢測 選取五組5孔中剩余的2孔，吸取上清后置于流式管中離心5 min，后滴入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)進行細胞重懸，最后采用流式細胞儀檢測淋巴細胞細胞周期及凋亡水平。

1.3統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行一般統計描述、t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1BMSCs的一般特征 分離出的SD大鼠脛骨和股骨的BMSCs種植后1～3 d生長滯留，第4天呈對數生長，后生長較為平穩。對培養細胞進行顯微觀察，BMSCs形態呈梭形，胞體細長，胞體形狀較為均一；透射電鏡觀察提示該細胞胞核較大，以類圓形、圓細胞為主；細胞質細胞器較少；染色質電子密度較低、分布稀疏。

2.2五組淋巴細胞增殖能力的比較 五組樣本的吸光值由大到小分別為：B組>A組> E組>D組>C組。A組的吸光度低于B組(P<0.05)，說明PHA對淋巴細胞的增殖有促進作用；隨著BMSCs數目的增加，樣本吸光度逐漸降低(P<0.05)，A、B組的吸光度均高于E、D、C組。

2.3五組淋巴細胞周期及凋亡 A、B、C、D、E組的淋巴細胞處于G0/G1期的百分比分別為：98.2%、89.5%、97.2%、97.1%、97.0%，僅B組淋巴細胞有10.5%處于S期，B組淋巴細胞相對其他四組增殖活動較為活躍；五組淋巴細胞凋亡水平從小到大依次為：B組

3 討 論

間充質干細胞(MSC)的多向分化潛能在細胞因子替代治療、基因治療、組織工程中及器官移植等方面應用極為廣泛〔6，7〕。BMSCs既是間充質細胞的一種，也是骨髓中的一種成體干細胞〔8〕。BMSCs可誘導分化為胰島細胞，從而可解決DM治療的細胞來源和免疫排斥等問題，是采用細胞移植治療DM最理想的來源〔9～11〕。BMSCs可通過一些免疫介質抑制T1DM患者淋巴細胞的增殖能力，從而控制炎性反應。

PHA是運用先進的超低溫冷凍技術從紅蕓豆中提取的一種有絲分裂原，它能夠激活免疫細胞(如淋巴細胞)。張秋堂等〔12〕發現，PHA刺激外周血單個核細胞24 h，CD3+、CD8+細胞比例明顯增加，CD3+、CD4+、CD3+、CD56+細胞比例變化不大，而CD3-、CD56+細胞比例顯著減少。本研究進一步驗證了PHA對淋巴細胞增殖的促進作用。對BMSCs而言，細胞主要形態為梭形，胞體細長，胞核較大，細胞質細胞器較少，染色質電子密度較低，分布稀疏。本研究結果發現，BMSCs的數目越多，其對淋巴細胞的增殖抑制作用越強。

細胞周期包括間期〔G1期、S期與G2期〕和分裂期(前期、中期、后期和末期)。本研究說明B組淋巴細胞增殖活動較為活躍；而對和不同數目BSMCs一起培養的淋巴細胞而言，其淋巴細胞的凋亡水平高于單純淋巴細胞培養的凋亡水平，并且隨著BSMCs的數目增多，淋巴細胞的凋亡水平逐漸升高。

綜上，BSMCs對淋巴細胞的增殖有抑制作用，且隨數目增多，其抑制作用越強。

4 參考文獻

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