胰島素對葡萄糖轉蛋白4轉運調節的研究進展

江 雷 龔 劍 江 波

(安徽建筑大學，安徽 合肥 230022)

葡萄糖轉運蛋白(GLUT)4是葡萄糖轉運蛋白家族的一員，主要分布在骨骼肌細胞和脂肪細胞，在胰島素刺激或肌肉收縮運動時，促進細胞攝取葡萄糖。在GLUT家族中，只有GLUT4參與骨骼肌細胞和脂肪細胞的GLUT循環。在靜息狀態下，GLUT4迅速轉向細胞內，而且向細胞膜的再轉運過程很緩慢。由于細胞對GLUT4緩慢的胞吐作用和快速的內吞作用，超過90%的GLUT4在細胞內，只有4%～10%在細胞膜上。GLUT4在靜息狀態下積聚在細胞內囊泡膜上，這些囊泡包括反式高爾基網(TGN)、再循環內體(RE)、不同的管囊狀小體。GLUT4對胰島素作用反應敏感，表現為在細胞膜上含量迅速增加，在細胞內含量迅速下降。脂酰肌醇3-激酶(PI 3-kinase)IAⅢ型在GLUT4的轉運過程中起重要作用。在少量鳥昔三磷酸(GTP)酶的作用下，PI 3-kinase→非典型蛋白激酶PKC和→Aκt/PKB →AS160是GLUT4向細胞膜轉運的主要調節通路。近10年，對GLUT4轉運信號調節的研究取得較大進展。本文就Akt/PKB下游事件，含GLUT4囊泡的來源，GLUT4在細胞膜上募集、錨定、融合等方面的研究進展進行綜述。

1 用于研究GLUT4轉運的細胞模型

很多對于GLUT4轉運途徑的認識和研究是通過對肌肉和脂肪細胞系的研究得來的。這些細胞系與成熟細胞很相似，但又不完全相同。3T3-L1脂肪細胞被認為是較好的模型而廣泛運用。3T3-L1脂肪細胞在接受胰島素刺激后，對葡萄糖的攝取比基礎水平提高10倍，而分離出來的大鼠脂肪細胞提高20倍，人的脂肪細胞則只提高2～3倍。在3T3-L1脂肪細胞，GLUT4主要儲存在細胞核周圍的囊泡膜上，在細胞質其他部位的囊泡含量很少。有研究表明，細胞中存在特定的含GLUT4小室，受胰島素調節，在最后的與細胞膜融合過程中需要突出小泡膜蛋白(VAMP)2存在并發揮作用。這些小室被命名為專門小室(SC)和GLUT4儲存囊泡(GSV)〔1〕。胰島素既能促進GLUT4從RE向SC/GSV轉運，又能促進GLUT4從SC/GSV向細胞膜轉運〔2〕。在成熟的脂肪細胞和肌細胞，GLUT4能較長時間保持活性(半衰期大約40 h)，所以每一個多肽鏈在其活性狀態可以多次循環到細胞膜上。

肌肉和脂肪細胞受到胰島素刺激后，GLUT4胞吐速率迅速增加，內吞作用少量減少，10～15 min細胞膜上的GLUT4即可達到峰值。胰島素受體1磷酸化， PI 3-kinase、PKC、Akt/PKB的活性提高也參與調節。包括Cbl-CAP-APS-Crk Ⅱ-C3G-TC10序列的PI3激酶信號因子促進脂肪細胞膜獲得GLUT4，而對肌肉細胞沒有作用。在肌肉細胞，PI3激酶促進表層肌動蛋白重建，不受Akt約束。重建的表層肌動蛋白可能參與“熱點”的產生，所以對細胞膜獲得GLUT4有關鍵作用?！盁狳c”是胰島素信號因子作用于細胞以及囊泡與細胞膜融合的位置。

2 胰島素對GLUT4儲存和胞吐作用的調節

目前一致公認，細胞膜依靠胰島素獲得GLUT4需要IA家族PI3激酶。但是PI3激酶是否參與GLUT4在小室的儲存、 GLUT4向細胞膜轉運的動員、轉運體的內吞，直到最近才有所了解。Foster等〔3〕研究表明，GLUT4在內體間快速轉運需要PI3激酶的活化。Yang等〔4〕研究表明，細胞膜上的PI3激酶對轉運體胞吐的作用比內吞作用更明顯。IA家族PI3激酶受胰島素刺激后,生成磷酸肌醇PI(3,4,5)P3。PI(3,4,5)P3通過載體進入脂肪細胞或肌肉細胞，能提高GLUT4向細胞膜的動員〔5〕。

磷酸肌醇信號可能是通過PDK1及其下游分子PKB、PKCζ/λ傳導。運用失活突變型、特定的基因敲除或基因沉默技術，表明這些酶在胰島素誘導的細胞膜獲得GLUT4的過程中都起作用〔6〕。PKCλ與胞外分泌有關，與驅動蛋白KIF3B結合的Rab4酶突變失活，則這一作用被抑制。Rab4酶被認為調節GLUT4通過微管向細胞膜動員。

Akt/PKB與GLUT4循環的多個步驟有關。Akt/PKB進入細胞內小室的證據包括：①在胰島素作用下，Akt/PKB向含GLUT4的內膜轉移〔7〕；②在Akt/PKB表達缺陷的細胞中，阻止了GLUT4在內體間的快速轉運〔8〕；③有活性的Akt/PKB作用于含GLUT4的小室， GLUT4嵌合體與Akt/PKB融合〔8〕，IRAP(SC/GSV的替代運輸蛋白)與細胞膜融合〔9〕；④在Akt/PKB表達缺陷的3T3-L1脂肪細胞，阻止胰島素促使的GLUT4易位〔9〕，在大鼠脂肪細胞無此現象〔8〕。AS160是Akt/PKB的底物。突變的AS160被稱為AS160-4P，Akt/PKB與它作用相對應的4個靶點發生變異。AS160-4P可抑制胰島素誘導的細胞膜GLUT4增加〔10〕。運用全內反射熒光顯微技術，用綠色熒光蛋白(GFP)標記GLUT4，形成 GFP-GLUT4。在表達AS160-4P的細胞，在膜周圍沒有發現胰島素刺激引起的來自RE的GFP-GLUT4和含GFP-GLUT4的囊泡〔10〕。這些結論表明，AS160可能參與了胰島素誘導的GLUT4從SC/GSV的外流，而AS160-4P阻止GLUT4的外流。最近，在免疫純化的含GLUT4的小室(包括SC/GSV，可能還有其他的含GLUT4的囊泡)，AS160有3個可能的Rab靶點(Rab 2A，8A，14)被發現〔11〕。進一步研究揭示Rabs和其靶點，在從胰島素受體到胰島素敏感的含GLUT4的小室之間的信號通路中可能起作用。Rab11調節膜蛋白從內體向膜和從內體向(TGN)的轉運。Rab11拮抗肽的表達阻止GLUT4從富含TfR的小室分離，說明其可能與GLUT4在內體小室間的轉運有關〔12〕。

3 胰島素對GLUT4入胞作用的調節

入胞作用包括入胞的起始階段和經入胞途經對內吞蛋白的轉運。GLUT4的入胞主要經由網格蛋白小窩。GLUT4通過與接頭蛋白2的μ2亞單位的相互作用，在GTP酶發動蛋白的幫助下，使含GLUT4囊泡從膜上分離。陷窩蛋白(caveolin)對GLUT4入胞也起作用。與肌動蛋白微絲共定位的EH結構域綁定蛋白(EHD)2和它的伴侶EHD2-結合蛋白(EHBP)1與GLUT4的入胞有關。它們的基因沉默減少GLUT4的入胞〔12〕。然而，因為網格蛋白和它關聯的適配蛋白與EHBP1作用于不同的蛋白入胞過程，GLUT4的入胞機制還需要進一步研究。

胰島素降低GLUT4的入胞速率，通過內吞囊泡加速其轉運〔3〕。胰島素延緩GLUT4入胞的信號通路仍然需要研究。過度表達AS160-4P輕微增加膜上GLUT4的入胞作用，說明AS160在這一過程中可能起作用〔10〕。初生的入胞小泡迅速(2 min內)轉運到早期內體(EE)，再到RE。胰島素降低存在于EE的GTP酶 Rab5的活性；在PI3激酶存在的情況下，也降低馬達動力蛋白與微管相互作用。這些事件延緩了GLUT4從細胞膜到EE的進程。隨后，胰島素加速GLUT4通過RE向SC/GSV的轉運，而且這一過程與IA家族PI3激酶和Akt/PKB有關〔3〕。含GLUT4內體的轉運可能還有PI5激酶PIKfyve的參與。雖然PI5激酶PIKfyve能被Akt/PKB磷酸化，但是，胰島素對其活性的影響還需要進一步研究。

4 胰島素對含GLUT4囊泡與細胞膜融合的調節

除了上述IA家族PI3激酶參與含GLUT4內體的轉運，近來有報道，抑制這些酶的活性，仍然在細胞內周緣獲得大量沒有完成對膜插入的GLUT4。這一現象可能是因為GLUT4在內體同時存在不同的抗原決定部位。在成肌細胞和脂肪細胞，100 nmol/L渥曼青霉素可以抑制IA家族PI3激酶活性，同時卻出現胰島素誘導的GLUT4在細胞膜周圍大量堆積〔13〕。但是這些GLUT4第一胞外環結構被改變，阻止細胞外周myc或HA抗原決定簇對其識別。經渥曼青霉素和胰島素預處理后的細胞，用電子顯微鏡也能看到含GLUT4的囊泡停留在細胞膜〔13〕。由于無論細胞是否受胰島素刺激，都沒有觀察到含GLUT4囊泡與細胞膜融合，這一結果表明含GLUT4囊泡與細胞膜融合需要IA 家族PI3激酶。在L6肌細胞，載體傳遞PI3激酶的主要產物PI(3,4,5)P3，引起含GLUT4囊泡與細胞膜融合〔5〕；PI3激酶下游蛋白激酶Akt/PKB的活性隨溫度從19℃到37℃變化而變化〔14〕，含GLUT4囊泡與細胞膜的融合現象也隨之發生變化。此外，另一個PI3激酶效應器——PKC，通過與80K-H和Munc18c的復雜作用，提高VAMP2綁定在突觸前膜上的蛋白syntaxin4，完成對融合事件的調節。siRNA降低磷脂酶D1表達，發現磷脂酶D1也調節含GLUT4囊泡與細胞膜的融合〔15〕?？偠灾?，PI3激酶IA和亞型相關蛋白與胰島素引發的含GLUT4囊泡與細胞膜的融合有關。

囊泡與膜的融合受(SNARE)蛋白調節。胰島素刺激引發細胞膜獲得GLUT4的過程可被SNAREs (VAMP)2(a v-SNARE)，syntaxin4和SNAP23(two t-SNAREs)阻止〔16〕。v-SNAREs VAMP3 或 VAMP7 沒有阻止這一過程〔1〕。有趣的是，VAMP2的干擾不會改變未受刺激靜息狀態下的細胞膜GLUT4水平。因為在免疫純化的GLUT4小室(可能是SC/GSV)發現VAMP2，說明持續再循環的GLUT4囊泡和胰島素動員的GLUT4囊泡可能有不同的v-SNARE補體促進其在細胞膜的錨定和融合。

最近運用全內熒光反射技術研究大鼠脂肪細胞發現，在距離細胞膜100 nmol/L以內，胰島素可能通過錨定事件減緩GLUT4-GFP的移動。這些結論表明，在基礎狀態，GLUT4囊泡到達細胞膜，但是并沒有錨定。錨定/融合是受胰島素調節的〔17〕。實際上，出胞復合物，特別是Exo70，引導囊泡到與膜融合的精確位置。隨后，囊泡上的VAMP2與膜上的t-SNAREs syntaxin4和SNAP23形成SNARE復合物。Munc18c，Synip和Tomosyn與synatxin4綁定，抑制胰島素誘導的GLUT4與細胞膜融合〔18〕。這些蛋白可能受胰島素調節，而且Synip就是被At/PKB磷酸化，從而空出syntaxin4的〔18〕。可是， Akt/PKB磷酸化丙氨酸殘基，使得適宜的Synip磷酸化被競爭，卻沒有阻止依賴胰島素的GLUT4在細胞表面的聚集。雖然如此，出現證據支持源自胰島素的信號對SNARE復合物能進行有效調節，其機制值得進一步的研究。

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