秦巴山區(qū)柿葉中揮發(fā)性成分及抗氧化性研究

豆佳媛，王奇，馮鞏

（陜西理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723000）

柿葉為雙子葉柿樹科（Ebenanceae） 柿樹屬（Diospyros）植物柿（Diospyros kaki L.f.）的葉。柿樹為常綠或落葉喬木或灌木，主要生長在熱帶和溫帶，約有6 屬450種，其中我國有柿樹2 屬50 多種，栽培面積約2.0×105hm2，產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的50%以上，是世界上最主要的柿樹生產(chǎn)國。柿樹在我國已2000 多年的栽培歷史，也是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一。柿葉中含有豐富的維生素C、黃酮、蘆丁、多種氨基酸及鐵、鋅、鈣等對(duì)人體有益的營養(yǎng)成分，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療保健作用。目前，我國柿葉開發(fā)的產(chǎn)品種類較少，品質(zhì)低。最成功的是在柿葉茶制備技術(shù)的研究上。關(guān)于柿葉化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，其揮發(fā)性成分及生物活性的研究國內(nèi)外更少有報(bào)道，而且主要集中在揮發(fā)油提取工藝和化學(xué)成分分析研究上[1-5]。近年來的研究表明柿葉具有明顯的抗氧化作用。石錦芹等[6-7]的研究表明，柿葉無水甲醇提取物對(duì)豬油的抗氧化作用較強(qiáng)，優(yōu)于柿葉無水乙醇提取物、體積分?jǐn)?shù)70%甲醇提取物和體積分?jǐn)?shù)70%乙醇提取物；而柿葉水提取物的抗氧化作用不明顯。用不同溶劑提取的柿葉提取物的抗氧化性能不同。馬希漢等[8]研究認(rèn)為，柿葉的石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物均有很強(qiáng)的抗氧化作用，而以石油醚提取物抗氧化作用最強(qiáng)。對(duì)上述各類提取物中有效成分的系統(tǒng)分析還未見到報(bào)道。為了開發(fā)利用柿葉，本文僅報(bào)道作者對(duì)其脂溶性揮發(fā)性成分用GC/MS/DS 聯(lián)用技術(shù)分離鑒定及相對(duì)含量的測定結(jié)果，并進(jìn)行了抗氧化活性的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

GC6890N/MSD5973N 色質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；PDP11/24 計(jì)算機(jī)及11/250 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；UV-6系列紫外可見分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司。

經(jīng)過處理的無水乙醚、石油醚、氯化鈉、無水硫酸鈉、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉等試劑均為分析純。

1.2 樣品及揮發(fā)性成分的提取

被分析的柿葉取自秦巴山區(qū)（5月初的鮮葉）用自來水將鮮柿葉洗凈、風(fēng)干、粉碎，取300 g 放入索氏提取器用石油醚提取，減壓濃縮后，在100 mL 燒瓶內(nèi)，加水至瓶1/2 高處使試樣完全浸透后進(jìn)行蒸餾，蒸至餾出物無味為止。蒸出物中加入25 g/L 的氯化鈉水溶液以提高萃取率[9]，萃取3 次，用無水硫酸鈉除去萃取液中的水，揮發(fā)乙醚后得到黃綠色揮發(fā)油，有較濃的清香味，待用。

1.3 GC/MS 分析

測試條件：GC 汽化室溫度250 ℃，HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，50 ℃恒溫2 min，然后以4 ℃/min 的升溫速率由80 ℃程序升溫至290 ℃，恒溫30 min，載氣為99.999%高純氦。

MSD 離子源為EI 源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV；使用美國NIST05 譜庫。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂溶性揮發(fā)性成分

柿葉的揮發(fā)油，經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜分離出26 個(gè)組分，見表1。

經(jīng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離和鑒定，運(yùn)用氣相色譜面積歸一化法確定各組分的相對(duì)含量，分離出26種組分，鑒定出26 中化合物，其中有21種含氧化合物，其在揮發(fā)性成分中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.237%。以4-甲基-2.6-二特丁基苯酚（39.967%）、植烯醇（6.831%）、2-甲氧基-3-丙烯基-苯酚（4.578%）為主。這26 個(gè)組分中，酚類物質(zhì)有5種，酮類物質(zhì)有4種，酸類物質(zhì)有4種，醛類物質(zhì)有2種，酯類物質(zhì)有1種，醇類物質(zhì)有1種，其中酚類物質(zhì)相對(duì)含量為44.915%，是柿葉揮發(fā)油的主要成分，說明柿葉揮發(fā)油具有較強(qiáng)的抗氧化作用。

表1 柿葉中揮發(fā)油組分分析Table1 The components analysis of volatile oils in Persimmon leaves

2.2 體外·OH 自由基清除作用考察

用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[9]測定Fe2+/ H2O2體系中·OH 自由基清除率。準(zhǔn)確稱取柿葉揮發(fā)油0.087 g，用蒸餾水配制成0.18g/L 的柿葉揮發(fā)油溶液，取6 只已編號(hào)的25 mL 容量瓶，分別加入0.75 mmol/L 鄰二氮菲溶液1.0 mL，pH 7.4 的0.2 mol/L PBS（磷酸鹽緩沖液）1.5 mL，混合均勻，分別加入0.75 mmol/L 新配置的硫酸亞鐵溶液1.0 mL，向1～6 號(hào)量瓶中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 柿葉揮發(fā)油溶液，搖勻，再向每只量瓶中加入新配制的0.01 % H2O2溶液1 mL，另取2只25 mL 量瓶并分別標(biāo)記為損傷管和未損傷管，這2 只量瓶中均不加柿葉揮發(fā)油溶液，且在損傷管中加入0.01%H2O2溶液1 mL，未損傷管不加H2O2，用蒸餾水將8 只容量瓶定容到至刻度，充分搖勻，于37 ℃恒溫水浴中培養(yǎng)60 min，取出，冷卻至室溫，于512 nm 測定吸光度（n=3）。按下式計(jì)算·OH 自由基清除率（I）。

式中：A2為柿葉揮發(fā)油溶液的吸光度；A1為未損傷溶液的吸光度；A0為損傷溶液的吸光度。繪制柿葉揮發(fā)油質(zhì)量濃度-清除率曲線見圖1。

圖1 柿葉揮發(fā)油對(duì)體外·OH 自由基清除作用曲線Fig.1 Volatile oils in persimmon leaves of·OH radical scavenging effect in vitro

由圖1可知，柿葉揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)H2O2/Fe2+體系通過Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 自由基有明顯的清除作用，且隨著揮發(fā)油濃度的增加呈明顯的上升趨勢，當(dāng)濃度為0.008 6 g/L 時(shí)，體外·OH 自由基清除率達(dá)44.95%，充分說明了柿葉揮發(fā)性物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3 結(jié)論

用GC/MS/DS 聯(lián)用技術(shù)測定對(duì)秦巴山區(qū)五月份柿葉用石油醚提取、水蒸氣蒸餾提取其中脂溶性揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定，運(yùn)用氣相色譜面積歸一化法確定各組分的相對(duì)含量。分離出26種組分，鑒定出26 中化合物，其中有21種含氧化合物，其在揮發(fā)性成分中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為84.237%。以4-甲基-2.6-二特丁基苯酚（39.967%）、植烯醇（6.831%）、2-甲氧基-3-丙烯基-苯酚（4.578%）為主。同時(shí)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行考察。柿葉中揮發(fā)油對(duì)Fe2+/H2O2體系·OH 基自由基的清除作用，隨著加入量的增加，清除率呈明顯的上升趨勢，當(dāng)達(dá)到一定濃度時(shí)，其對(duì)·OH 自由基的清除率基本保持不變。清除率和柿葉中揮發(fā)性物質(zhì)用量存在一定的量效關(guān)系，均可以說明柿葉中揮發(fā)油具有很強(qiáng)的抗氧化性。該研究尚屬首例，為進(jìn)一步柿葉的利用提供理論支撐，柿葉的其他生物活性實(shí)驗(yàn)和開發(fā)利用還有待研究。

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