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濃香型白酒釀造微生物研究進展

2014-01-29 01:41:49程偉吳麗華徐亞磊秦俊哲謝國排王明才
中國釀造 2014年3期
關鍵詞:酵母菌研究

程偉,吳麗華,徐亞磊,秦俊哲,謝國排*,王明才

(1.安徽金種子酒業股份有限公司,安徽阜陽236023;2.陜西科技大學生命科學與工程學院微生物中心實驗室,陜西西安710021)

濃香型白酒釀造微生物研究進展

程偉1,吳麗華1,徐亞磊1,秦俊哲2,謝國排1*,王明才1

(1.安徽金種子酒業股份有限公司,安徽阜陽236023;2.陜西科技大學生命科學與工程學院微生物中心實驗室,陜西西安710021)

在傳統固態白酒釀造過程中,微生物對白酒的產量、品質、風味等都起著重要作用。該文以濃香型白酒生產的關鍵工藝為依據,對酒曲、窖泥、酒醅微生物的研究現狀進行闡述,從參與釀造過程微生物的角度了解白酒發酵、生香、產酯等過程的實質,為濃香型白酒生產中釀造微生物的進一步研究提供思路。提出釀造微生物與白酒品評中“色、香、味、格”之間的聯系,尤其是釀造微生物與白酒中呈香呈味物質的相關性研究,將是今后白酒風味化學研究的重要方向與趨勢。

濃香型白酒;釀造;微生物

中國傳統白酒是以淀粉質或糖質原料,加入糖化發酵劑(糖質原料無需糖化劑),經固態、半固態或液態發酵、蒸餾、貯存、勾兌而制成的蒸餾酒[1];其釀造的實質是主要來源于酒曲、窖泥、酒醅以及工藝操作環境的相關微生物,參與淀粉糖化、酒精發酵、產酯生香等生化過程。釀造微生物的種群、生態分布、數量及其代謝過程等對白酒的發酵,產物的生成及其類別都有著重要作用,也是影響白酒典型香型的重要因素。因此,釀造微生物的研究水平關系到白酒工業的技術創新,影響白酒的品質、產量及其風格特征;釀造微生物的群落結構,特別是風味功能微生物的群落結構對白酒風格、品質等均起到關鍵作用。

濃香型白酒又稱瀘香型,其典型代表是瀘州老窖特曲,主題香型為己酸乙酯,在我國白酒工業中占有較大比例,又是三大基本香型(清香型、濃香型、醬香型)之一,其銷售份額約占全國白酒總量(或市場占有率)的70%左右[2]。現階段對濃香型白酒釀造微生物的研究大多集中在酒曲微生物的分離、鑒定、數量結構,發酵過程中微生物的群落演化規律及物質變化特點,窖泥中功能性微生物的研究及應用等幾個主要方面[3]。本文就酒曲微生物及其酶學研究、酒醅微生物及發酵風味物質研究、窖池及窖泥功能微生物的研究與應用等方面,對中國濃香型白酒釀造微生物的研究進展進行綜述。

1 酒曲微生物及其酶學研究

中溫曲作為濃香型白酒生產的糖化發酵劑,是多種微生物及其產生的各種酶類的載體;整個制曲工藝過程,有眾多微生物先后交替,產生多種酶類,共同作用,關系復雜[4],最終關系到產酒香型、品質及數量;因此,對酒曲微生物的研究必將帶來制曲、釀酒技術的發展。

1.1 酒曲微生物的分離、鑒定

由混合菌群組成的濃香型酒曲微生物主要包括細菌、霉菌、酵母菌。姚萬春等[5]比較系統地研究了瀘州老窖國窖曲微生物。結果表明,其曲心以細菌為主,外層主要分布霉菌、酵母菌;培菌初期以細菌、酵母菌為主,中后期霉菌為優勢類群;當品溫接近室溫、曲磚含水量降低到一定程度時,其微生物的類群、數量基本保持穩定。

細菌是濃香型白酒酒曲中的一類重要微生物,在酒曲中發現的細菌主要有醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。胡桂林等[6]利用傳統微生物分離方法結合Biology自動分析系統,從濃香型白酒大曲中成功分離、鑒定一株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。廖建民等[7]對酒曲中的細菌菌系進行了研究,發現芽孢桿菌的數量和種類較多,無芽孢桿菌和球菌的數量較少;其中,無芽孢桿菌主要是乳酸桿菌、醋酸桿菌,球菌主要是乳球菌類,且種類比較單一。

霉菌是濃香型白酒酒曲微生物的組成部分,在酒曲中發現的霉菌主要有曲霉、根霉、毛霉、犁頭霉、青霉等。張霞等[8]從濃香型白酒酒曲中分離到104株絲狀真菌(霉菌),通過傳統方法初步鑒定歸類為14個類群;通過18S rDNA序列分析,把菌株初步歸類為MJ-I至MJ-Ⅴ5個主要類群,依此構建系統發育樹。馬蕤等[9]從來源于湖北民間的傳統酒曲中分離得到產糖化酶活力較高的1株霉菌F14,常規法鑒定為米根霉(Rhizopus oryzae)。

酵母菌群對濃香型白酒的發酵作用起著至關重要的作用,參與釀酒過程的主要有酒精酵母、產酯酵母以及假絲酵母等酵母菌群。其中,酒精酵母是酒曲中主要的產酒功能菌;產酯酵母又稱為生香酵母,其以糖、醛、有機酸、鹽類為養料,在酯酶參與下合成酯類,形成濃香型白酒的特征風味。張磊等[10]從習酒大曲中分離到24株優勢酵母菌,選擇5株具有代表性的純培養菌株做系統鑒定。王小紅等[11]從鳳窩酒曲中分離得到產酒精能力相近的16株酵母菌,經鑒定表明其中7株為假絲酵母菌屬,9株為釀酒酵母屬。

1.2 酒曲微生物酶學研究

根據催化功能不同,濃香型白酒酒曲中的酶系主要分為淀粉酶、蛋白酶、酵母胞內酶等。其中淀粉酶主要是將原料中的淀粉分解生成糊精、麥芽糖,最終轉化為葡萄糖。酒曲中的枯草芽孢桿菌、白曲霉、米曲霉、黑根霉等微生物主要產生α-淀粉酶;黑曲霉、根霉、擬內孢霉、紅曲霉等霉菌主要產生糖化型淀粉酶,其中酶活力較高的主要由根霉、擬內孢霉、紅曲霉產生,基本可以完全水解淀粉。酒曲中的蛋白酶類主要為酸性、酸-中性蛋白酶,其水解產物主要是氨基酸與多肽,是微生物生長、繁殖的營養物質,并提供其生物體組成的結構物質;蛋白酶類在發酵后期生成的高級醇、醛、酮等有機物是形成白酒風味的關鍵成分[4]。其中,酸性蛋白酶主要來源于米曲霉、根霉、黑曲霉;中性蛋白酶主要來源于芽孢桿菌、灰色鏈霉菌、米曲霉、棲土曲霉及轉化微白色鏈霉菌等。酵母胞內酶中直接參與白酒發酵過程的主要有酒化酶、酯化酶、雜醇油生成酶等。

濃香型白酒酒曲中的酶系還有氧化還原酶、纖維素酶、單寧酶、裂解酶、異構酶等。酒曲的生化特性決定著酒質的優劣,因此在制曲及其質量控制中,既要保持液化酶、糖化酶、酒化酶等生物酶的存在及其活性,又要使酒曲中產生適當的蛋白水解酶與酯化合成酶等生物酶系,才能達到高產優質的目的[12]。羅文等[13]從4種酒曲中成功分離得到3株具有較強的生淀粉水解能力的根霉菌,2株具有較強發酵產酒精能力的酵母菌。張東亮等[14]成功篩選出糖化和酯化能力均較高的生料釀酒用曲霉菌[15]。沈怡方[16]指出:“由于各種糖化發酵劑所含微生物的種類、數量及其酶系種類與活力的不同,導致釀酒發酵代謝產物的差異,進而影響白酒的風味、質量”。

2 酒醅微生物及發酵風味物質研究

2.1 酒醅微生物種群、分布及微生態研究

復雜的酒醅微生物區系是白酒釀造微生物多樣性研究的重點之一,發酵微生物代謝產生的酶類,其催化生化反應的作用是構成酒體風味物質的前提。學者對瀘州老窖、五糧液等著名濃香型白酒的糟醅微生物進行了比較深入的研究,成功運用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)及指紋圖譜技術監測酒糟微生物區系的分布、消長等動態變化過程[17]。結果表明,細菌多分布于酒醅上層,酵母菌主要分布于酒醅下層,霉菌較少;好氧細菌、兼性厭氧細菌、霉菌和酵母菌的數量在發酵初期增長較快,各類微生物的數量隨著發酵的進行均有所減少;在發酵中期,細菌、酵母菌先后成為優勢菌群;臨近出窖時,酵母菌數減少,芽孢桿菌數增加,發酵后期基本上已不能檢出霉菌[18-19]。

地區間生態壞境的不同造成釀造微生物的明顯差異。如濃香型白酒中的全興酒、貴州習酒,與瀘州老窖相比,乳桿菌屬(Lactobacillus)是糟醅中的優勢細菌;在宜賓多糧濃香型白酒的酒糟中,芽孢桿菌屬(Bacillus)是優勢菌群[20]。從酒曲微生物、窖泥微生物以及來自工藝操作環境的微生物,相互演化形成的糟醅微生物區系,結合窖池微生態環境共同構成酒醅微生態系統。研究酒醅微生態系統的起源、結構、演變規律有利于認識和理解濃香型白酒獨特風味的形成機理,達到指導生產、進行質量控制、改良酒體風格等目的[21]。窖池不同層面的糟醅微生物的數量分布差異,受到地域環境、土質、窖池的形狀及其大小、操作工藝等諸多因素的影響;糟醅上、中層的微生物數量比下層略高,且酵母菌類的數量較為明顯;不同季節,在同一層面上微生物的數量分布基本上趨于一致,差異不大[22-23]。

2.2 釀造微生物與濃香型白酒風味物質的形成研究

濃香型白酒的釀造微生物主要包括細菌、放線菌、酵母菌、霉菌等。其在發酵過程中相互影響、相互制約,生成各種生物酶類,將淀粉、蛋白質等物質原料在多酶催化作用下轉化成醇、醛、酸、酮、酯等物質,進而形成各種代謝產物,使原酒中的主體香、輔助香等風味物質相輔相成,“香、味、格”較為統一協調。己酸乙酯是濃香型白酒的主體香,己酸菌產生的己酸是其形成的前體物質,己酸菌以窖泥為生存環境。因而,窖泥齡越老的窖池中己酸菌等功能菌越多,其代謝產生的己酸越多,在曲藥酯化酶的催化作用下己酸與乙醇反應生成的己酸乙酯越多,濃香型白酒主體香越突出,風格越典型,質量越好[24]。

甲烷菌與己酸菌共酵培養“人工老窖”技術的應用,使四大酯類之間更趨平衡,提高了己酸乙酯生成量,產酒質量有較大提高[25]。張麗鶯[26]研究了瀘州老窖糟醅中的細菌區系,發現并鑒定其主要功能性產香菌為芽孢桿菌與芽孢乳桿菌。熊昌緒[27]發現新疆“八一”特曲糟醅中多為G-桿菌產香。羅志騰[28]對西安大曲糟醅進行研究,發現其產香菌主要為芽孢菌、節桿菌以及醋酸桿菌。諸多研究表明,濃香型白酒窖池中的產香細菌大多數為芽孢菌;但也有研究顯示,梭狀芽孢桿菌對濃香型白酒呈香呈味貢獻最大,其主要代謝產物是己酸、丁酸和氫;研究還發現,己酸菌和甲烷菌共生時能促進己酸生成[29-30]。

濃香型酒曲中的酯化酶對己酸乙酯的轉化起到關鍵作用,但其對形成濃香型白酒的主體香型并不是決定性的。氣相色譜分析、液相色譜分析、氣質聯用分析等技術相繼應用于白酒風味物質的研究上,在酒體香味成分分析方面的研究有了突破性的進展[31]。目前,對于濃香型白酒風味物質的形成與釀造微生物之間的關系研究,通常都停留在釀造水平上,功能微生物的作用與風味物質的形成之間的確切關系尚不清楚,還有待于進一步的研究。

3 窖池及窖泥功能微生物的研究與應用

3.1 窖池微生態研究

來源于酒曲、窖泥、工藝操作環境等的各類微生物,在窖泥與糟酷之間不斷進行菌群遷徙、演變、物質能量交換,形成糟酷微生物區系,最終達到相對平衡,完成白酒固態發酵的基本過程。因而,可以應用獨立的微生態系統分析方法,研究濃香型白酒的固態發酵窖池的微生態;研究表明,不同窖池微生物的多樣性與窖池微生態密切相關[32]。窖池微生態系統的重要組成部分包括窖池微生物的多樣性,物質能量代謝伴隨著微生物的消長變化共同作用于窖池微生態系統,相互作用,促進了窖池微生態系統演變。窖池中的菌種資源比較豐富,不同學者從窖池中分離得到能產抗生素、淀粉酶、類細菌素、木糖醇等的各類微生物;因此,研究窖池微生物的多樣性及其微生態,必將有助于工業微生物菌種資源的開發與應用。

3.2 窖泥功能微生物研究與應用

窖泥是濃香型白酒釀造微生物棲息的生態環境,其中的微生物種群的演替與代謝,整個過程中都體現出明顯的多態性。肖冬光[33]指出“濃香型白酒功能菌的生長繁殖主要以窖泥為載體,窖泥的品質影響已酸乙酯等香味物質的生成,對提高酒質起到關鍵作用”。對窖泥中微生物,特別是功能性微生物的種類、分布及其相互作用對發酵途徑、產物生成影響的研究,可以實際指導窖泥、窖池的護養、人工窖泥的制作等,以提高濃香型白酒質量。窖泥功能微生物研究主要集中在己酸菌、丁酸菌、甲烷菌、甲烷氧化菌等,窖泥中的乳酸菌未引起足夠的重視。

胡承等[34]研究了不同窖齡老窖厭氧菌群糟層分布特征。張肖克等[35]對窖泥微生物多樣性進行了研究,發現窖泥微生物種群主要為厭氧異氧菌、甲烷菌、己酸菌、乳酸菌、硫酸鹽還原菌、硝酸鹽還原菌等。指出由微生物種群的多態性必然引起微生物種群作用,進而影響的產酒數量與品質。姚繼承等[36]采用超濃縮己酸菌液制成的窖泥培養液,使窖泥中的功能微生物菌群得到激活和增加,顯著提高了原酒液中己酸乙酯的含量,四大酯比例較為協調,窖泥生香功能顯著。陳翔等[37]采用己酸菌與酵母菌、細菌、霉菌混合培養制成的己酸菌混合液,成功應用于窖泥中,使優級酒產率達到5.21%,出酒率提高至35%,解決了窖池改造后第一排無優級酒的情況。張群[38]將干制活性窖泥功能菌應用于三溝酒廠濃香型白酒生產中的窖池建設、窖泥培養及發酵過程。生產實踐表明,采用干制活性窖泥功能菌成本低、簡便易行、抗雜菌性能強、較人工培養己酸菌液節省水、電、汽、人工及培養設施,所產酒質具有典型的濃香型白酒風格。

3.3 人工窖泥的培養與應用

濃香型白酒的窖泥在使用過程中,表面會出現堿化、板結及其硬化,并伴隨有白色顆粒或針狀結晶體的現象,又稱窖泥老化。有學者通過分離、鑒定瀘州老窖的老窖泥微生物,確立了窖泥功能菌以己酸菌、丁酸菌等梭狀芽孢桿菌為為主體;并對老窖泥的成分進行研究,結果表明,老窖泥的組成包括腐植質、碳源、磷源、氮源、鉀源等成分;利用釀酒生產的原輔料,以純粘性黃泥為基質,仿效老窖泥成分配制營養源,接種純培養己酸菌或老窖泥復合菌發酵培菌,成功實現了老窖泥的人工培養,縮短窖泥老熟時間,奠定了濃香型白酒窖泥培養的技術基礎[39]。

目前,應用干制活性窖泥功能菌培養人工窖泥的生產技術比較成熟,可以維持老窖泥的優良性狀,提高濃香型白酒的質量[40-43]。吳金艷等[41]根據生產試驗,表明干制活性窖泥功能菌適應性較強,培養窖泥效果較好。生產3排(窖池生產循環3輪次)后,功能菌泥池與優質老窖池酒質比較接近,口味較諧調;圓排后,酒質穩定、酒體醇厚、窖香濃郁。穆文斌等[43]通過對古井酒廠窖泥生香過程的研究,初步掌握窖泥生香微生物的生長與代謝特點,研究出專門應用于窖泥培養的“生香微生物功能性營養液”,克服了人工窖泥培養中質量不穩定等問題,實現了人工窖泥的規模化生產。

4 結語

應用現代分子生物學技術、微生物育種技術、微生物種群分析技術等,實現濃香型白酒釀造過程中功能微生物的分離、培育與應用,進行功能微生物的種性分析、菌種改良等,揭示釀造微生物與白酒品評中“色、香、味、格”之間的聯系,尤其是釀造微生物與白酒中呈香呈味物質的相關性研究,將是今后白酒風味化學研究的重要方向與趨勢。對濃香型白酒風味物質的特征及其形成機理進行分析,結合現代風味化學研究,應用微生物生香發酵工程,調控窖池內釀造微生物的發酵、生香過程,實現對形成風味物質的功能微生物及其代謝途徑的調控,可以為增強濃香型白酒的典型風格、口感特色及其品質特征提供依據。

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Research progress on brewing microbes in the production process of Luzhou-flavor liquor

CHENG Wei1,WU Lihua1,XU Yalei1,QIN Junzhe2,XIE Guopai1*,WANG Mingcai1
(1.AnHui Golden Seed Winery Co.,Ltd.,Fuyang 236023,China;2.Microorganism Laboratory Center, College of Life Science and Engineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an 710021,China)

Microbes played important roles on liquor quality,flavor and others aspects in liquor making.Based on the traditional production process of Luzhou-flavor liquor,the research status of brewing microbes including liquor starter,cellar mud and fermented grains was reviewed in this paper. From the perspective of brewing microbes in Luzhou-flavor liquor-making process to understand the essence of liquor fermentation,perspectives for further study of brewing microbes could be provided.The relationship between brewing microbes and color,aroma,taste,and style of liquor was pointed out.The relationship between brewing microbes and liquor flavor substances will be the future research direction and trend of liquor research.

Luzhou-flavor liquor;brewing;microbes

TS261.1

A

0254-5071(2014)03-0001-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.001

2013-11-25

金種子集團校企合作曲酒技術攻關項目(13jk0823)

程偉(1984-),男,助理工程師,碩士,研究方向食品微生物技術。

*通訊作者:謝國排(1977-),男,高級工程師,本科,研究方向釀酒生產技術及企業管理。

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