益生乳酸菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制的研究進展

馬春艷，李少英 *，宋曉敏，李 貞，李淑芬

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌是無處不在且廣泛分布的微生物，作為益生菌來源的重要菌群之一，對食品、農(nóng)業(yè)、生物技術以及制藥行業(yè)都是非常重要的，這使得其的安全特性、生理特性和遺傳特性成為研究者們研究的主題。在生產(chǎn)各種發(fā)酵乳制品時，如奶酪、酸奶和發(fā)酵牛奶，乳酸菌是使用最廣泛的發(fā)酵劑。近年來研究表明，雙歧桿菌、植物乳桿菌等益生乳酸菌對抗革蘭氏陰性菌的抗微生物藥具有一定的耐藥性。抗微生物藥尤其是氟喹諾酮類藥物因其廣譜殺菌活性和良好的藥動力學特點，在臨床治療感染性疾病中得到持續(xù)廣泛的應用。在抗生素選擇壓力下造成很多耐藥乳酸菌的出現(xiàn)及其耐藥率的提高。當耐藥乳酸菌將攜帶的可轉移的耐藥因子傳遞給其他乳酸菌或者致病菌，將引起無法估量的后果。如ROSANDER A等[1]報道商用益生菌羅伊氏乳桿菌ATCC 55730存在潛在的可轉讓的抗性基因。因此，益生乳酸菌的生物安全問題需要被高度重視。基于上述原因，認識和了解乳酸菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制，為安全合理有效利用益生乳酸菌提供一定參考，同時為疾病的治療提供新的思路，也豐富臨床用藥依據(jù)。

1 氟喹諾酮類藥物

喹諾酮類藥物是一類化學合成類抗菌藥物，其基本結構是1，4-二氫-4-氧-3-喹啉羧酸。第一代喹諾酮類藥物是LESHER G Y等[2]在1962年發(fā)現(xiàn)的，由于其對厭氧菌無活性和革蘭氏陽性菌無作用，加之其抗菌譜窄，藥代動力學和安全性不理想，現(xiàn)已被取代。隨后逐步對第一代喹諾酮類藥物結構進行修飾，得到第二代喹諾酮類藥物，其主要用于治療腸道的感染。直到1978年，日本杏林公司[3]在C-6引入F 原子后得到第三代氟喹諾酮類藥物，其殺菌作用強且生物利用度高等特性使其得到廣泛地應用。第四代氟喹諾酮類藥物與前三代抗菌藥相比其抗菌能力進一步增強，尤其對革蘭氏陽性菌[4]。氟喹諾酮類藥物因其廣譜殺菌活性和良好的藥動學等特點，在臨床治療感染性疾病中得到廣泛的應用。然而，持續(xù)廣泛的應用甚至濫用氟喹諾酮類藥物的現(xiàn)象，造成很多耐藥菌株的出現(xiàn)及其耐藥水平的提高。

2 乳酸菌耐氟喹諾酮類藥物的原因

乳酸菌耐藥性的原因可分為獲得耐藥性和天然耐藥性。大多數(shù)研究認為乳酸菌耐藥性來源于3種途徑：①天然存在的耐藥性，是微生物為適應環(huán)境其自身通過改變堿基位置從而出現(xiàn)的耐藥性，如雙歧桿菌對萘啶酸和氟哌酸具有固有的耐藥性，嗜酸性乳桿菌對環(huán)丙沙星具有固有耐藥性[5]；②抗生素選擇性壓力，是細菌通過基因突變和自身代謝調(diào)節(jié)來生存和繁殖；③可移動基因元件（如質(zhì)粒、整合子、轉座子等）在細菌間的轉移[6-8]。細菌耐藥性是生物的自然現(xiàn)象，還可能是由于細菌的種、屬特性不同而造成的耐藥性。細菌對某種抗微生物藥產(chǎn)生耐藥性，就難以恢復對該抗微生物藥的敏感性。喹諾酮類抗菌藥的投入使用時間要短于其他抗菌藥，李巧芳[9]研究發(fā)現(xiàn)，細菌耐氟喹諾酮類藥物水平呈明顯上升的趨勢。近年來，國內(nèi)已經(jīng)有許多人對乳酸菌的抗生素敏感性進行了研究[10-12]，而其耐藥機制還不明確。所以對乳酸菌耐氟喹諾酮類藥物的機制進行全面深入研究十分緊迫重要。

3 乳酸菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的機制

國內(nèi)外研究較多的是致病菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制，而對于乳酸菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制的報道卻甚少。目前研究認為，乳酸菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的機制主要有3個方面：靶位的突變；外排泵的作用；質(zhì)粒介導。

3.1 靶位的突變

在細菌細胞內(nèi)，喹諾酮類藥物的作用靶位是脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ[13]。DNA旋轉酶在DNA復制和轉錄的起始階段起重要作用。DNA旋轉酶包含gyrA和gyrB基因，其中gyrA基因與DNA雙鏈的斷裂和重接有關，gyrB基因與三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的水解有關。在DNA復制后期的姊妹染色體分離過程中拓撲異構酶Ⅳ起著重要作用。拓撲異構酶Ⅳ有parC和parE基因，其中parC和gyrA、parE和gyrB具有高度同源性。氟喹諾酮類藥物能抑制細菌的DNA旋轉酶和拓撲異構酶IV的合成，藥物結合到酶-DNA二聚體上，穩(wěn)定共價結合的酶-酪氨酰-DNA磷酯鍵，形成三聚體復合物阻止DNA復制，導致細胞死亡[14]。

拓撲異構酶Ⅳ和DNA旋轉酶都是細菌細胞生長繁殖不可或缺的酶，由于編碼DNA旋轉酶和拓撲異構酶Ⅳ的基因發(fā)生突變，1997年MARTIN J G等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)突變位點多發(fā)生于parC和gyrA基因位點，即酶蛋白分子和DNA鏈結合的區(qū)域，這一區(qū)域發(fā)生氨基酸的突變將會影響到氟喹諾酮類藥物的結合。gyrA的最常見突變位點為83位及87位，parC的最常見位點為80位及84位，而gyrB和parE的突變發(fā)生率相對較低。1996年，JANOIR C等[17]研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性肺炎鏈球菌高水平耐培氟沙星、環(huán)丙沙星和司帕沙星是parC和gyrA共同突變導致的。通常對于腸桿菌科細菌在該喹諾酮耐藥決定區(qū)（quinolone resistance-determining region，QRDR）區(qū)域出現(xiàn)多個突變位點就可以帶來明顯的臨床耐藥性，如空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni），DNA旋轉酶發(fā)生Thr86-Phe，Asp90-Asn，Ala70-Thr突變[18-19]。以上耐藥機制的報道是對于細菌而言的，對于乳酸菌耐氟喹諾酮類藥物的機制還未有報道。直到2007年，ANJA S等[20]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性，他們研究了gyrA和parC基因的QRDR區(qū)，未發(fā)現(xiàn)典型的突變現(xiàn)象，并且提出耐藥基因可能存在但沒有表現(xiàn)出來。2008年，李少英[21]研究發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌和乳桿菌屬的菌株對喹喏酮類藥物（左氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星）產(chǎn)生耐藥與DNA 旋轉酶gyrA基因突變有密切關系，張燕燕[22]研究發(fā)現(xiàn)gyrA基因突變是乳酸菌對環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥性的主要機制。2011年，芮萍等[23]研究發(fā)現(xiàn)parC單一位點突變引起豬鏈球菌對氟喹諾酮類藥物低水平耐藥，而parC和gyrA雙位點突變引起其高水平耐藥。2012年，霍小琰[24]研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌耐氟喹諾酮類抗菌藥（環(huán)丙沙星和諾氟沙星）是由于gyrA基因位點發(fā)生突變造成的，證實乳酸菌對喹諾酮類抗菌藥產(chǎn)生的耐藥性與菌體DNA拓撲異構酶ⅡgyrA基因突變有直接關系。2013年姚杰等[25]研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌耐氧氟沙星、環(huán)丙沙星及諾氟沙星等6種氟喹諾酮類藥物是gyrA和parC突變導致的。關于突變發(fā)生率相對較低的gyrB和parE與乳酸菌的耐藥性關系國內(nèi)還未有報道，所以在此研究基礎上應該作進一步的研究。

3.2 外排泵作用機制

BALL P R等[26-27]在20世紀80年代研究大腸桿菌對四環(huán)素的敏感性發(fā)現(xiàn)主動外排系統(tǒng)（active efflux system）。細菌利用外排泵系統(tǒng)排出體內(nèi)對自己有害的物質(zhì)害，以適應周圍環(huán)境來更好的生長繁殖。外排泵蛋白是革蘭氏陽性細菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的一種非特異性重要途徑。1999年，賈蓓等[28]研究發(fā)現(xiàn)僅主動外排系統(tǒng)單獨作用就可引起細菌高水平耐藥的產(chǎn)生。2000年，POOLE K[29]研究發(fā)現(xiàn)主要易化超家族（major facilitator superfamily，MFS）型轉運蛋白在革蘭氏陽性細菌耐氟喹諾酮類藥物中占主導地位。2005年，張海旺等[30]也證實了細菌耐氟喹諾酮類藥物是單獨的主動外排機制導致的。2009年，LI X Z等[31-33]報道，氟喹諾酮類藥物在細菌細胞內(nèi)積累到一定濃度來抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成，活化的外排泵系統(tǒng)依靠跨膜轉運時質(zhì)子泵或鈉離子的電化學梯度的能量，使細菌細胞內(nèi)的抗菌藥排出體外，降低或消除了藥物對細菌的抑制。以上外排泵機制的研究是基于致病菌耐藥性而言的，其中對外排泵介導的益生菌耐藥性的研究，李少英[21]在2008年提出用2，4-二硝基酚來抑制雙歧桿菌和植物乳桿菌的主動外排系統(tǒng)，研究結果顯示，雙歧桿菌和植物乳桿菌存在主動外排系統(tǒng)介導的對環(huán)丙沙星抗菌藥的耐藥性。同年張燕燕[22]研究表明雙歧桿菌有外排系統(tǒng)作用介導的對環(huán)丙沙星耐藥的機制。除此之外，國內(nèi)還尚未有關報道，所以還有待進一步的研究。

3.3 質(zhì)粒介導

研究表明，許多細菌的耐藥性是通過質(zhì)粒來傳遞的，研究發(fā)現(xiàn)其傳遞能量來自抗微生物藥選擇壓力[34]。目前研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌耐喹諾酮類藥物是由質(zhì)粒抗性基因介導的主要有qnr家族[35-36]。qnr家族中qnrA競爭性抑制DNA旋轉酶與DNA的結合，從而抑制了喹諾酮類藥物對菌體的抑制或殺滅[37]。目前研究發(fā)現(xiàn)qnr家族流行較廣的有qnrS、qnrD和qnrB[38]。qnr家族基因的表達通常僅能傳遞低水平耐藥，但是攜帶該質(zhì)粒的細菌更易發(fā)生基因突變[35]。2007年李顯志等[39]研究發(fā)現(xiàn)aac（6′）-Ib-cr使環(huán)丙沙星和諾氟沙星藥物的化學結構中哌嗪環(huán)乙酰化，從而導致細菌對抗微生物藥耐藥水平降低。此外，AGUADO-URDA M等[40]研究發(fā)現(xiàn)格氏乳球菌的質(zhì)粒pGL4中的orf2基因、質(zhì)粒pGL5中的orf35基因與抗藥性有關，其中orf2基因編碼的含107 個氨基酸的蛋白質(zhì)可以把藥物泵出細胞膜外；orf35基因編碼五肽重復蛋白家族高濃度血小板血漿（platelet-richplasma，PRP），關于PRP的生物功能尚不清楚，只是發(fā)現(xiàn)與qnr蛋白相關。FUKAO M等[41]研究發(fā)現(xiàn)，短乳桿菌KB290的質(zhì)粒pKB290-2和質(zhì)粒pKB290-3中的一段基因編碼多重耐藥轉運蛋白。國內(nèi)對于質(zhì)粒介導的益生乳酸菌耐氟喹諾酮類藥物機制的研究甚少，有待進一步的研究。

近些年來，研究人員發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性細菌中有群體效應分子，其能提高細菌對不同環(huán)境的適應能力[42]。那么群體效應是否是益生乳酸菌對氟喹諾酮類藥物耐藥的又一個機制，這還有待進一步的研究。另外，目前已有研究認為乳酸菌對氨芐西林、紅霉素、四環(huán)素、萬古霉素和鏈霉素產(chǎn)生耐藥性是由于這些乳酸菌產(chǎn)生生物膜導致的[43]。乳酸菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性是否與生物膜的形成有關，目前國內(nèi)尚未有報道，還有待進一步研究。

4 小結

益生乳酸菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥主要原因是靶位的突變，且耐藥水平的提高與靶位突變的數(shù)目成正比。外排泵機制是導致益生乳酸菌耐多種藥物的重要原因。質(zhì)粒上的喹諾酮類藥物抗性基因aac（6′）-Ib-cr和qnr促使了其多藥耐藥性且提高了耐藥水平。益生乳酸菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性，亦或多重耐藥是這3種耐藥機制單獨存在或同時存在作用的[44]。另外，細菌群體效應的存在和細菌生物膜的形成也可能導致益生乳酸菌對氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥。特別引人關注的是，在將來可能出現(xiàn)耐藥基因的進化及新型耐藥特征的出現(xiàn)[45]。抗生素的使用和益生乳酸菌耐藥性發(fā)生傳播有直接的因果關系，因此對益生乳酸菌耐氟喹諾酮類藥物的機制需要進行全面深入的研究。

5 展望

益生乳酸菌對氟喹諾酮類藥物耐藥機制的相關進展警示我國對這方面的研究甚少。作為現(xiàn)在全球抗生素濫用最嚴重的國家，益生菌耐藥性也是最易出現(xiàn)的國家，這就要求我們不僅要進行前期的生物安全測試和后期的跟蹤檢測，如GUILLARD T等[46-47]使用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術建立了可以快速檢測出aac（6′）-Ib-cr、qepA和qnr等抗性基因的方法。還要加大力度全面深入的研究益生乳酸菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制，為選育對喹諾酮類抗菌藥具有抗性且其抗性基因相對穩(wěn)定，不會在細菌間傳遞轉移的益生乳酸菌奠定基礎。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，益生乳酸菌對抗菌藥具有耐藥性，而且這種耐藥基因不會發(fā)生轉移，就可以將益生乳酸菌微生態(tài)制劑與喹諾酮類抗菌藥相結合，來治療腸道病原菌感染引發(fā)的各種腸道疾病，同時可以維持腸道正常菌群的平衡。此外，通過對益生乳酸菌耐藥機制的研究可以擴大其微生態(tài)制劑的應用范圍，這為安全高效地使用益生乳酸菌開辟新的途徑。除此之外，我國應開展抗菌藥物專項整治活動，如合理用藥、研發(fā)新結構藥物和優(yōu)化現(xiàn)有藥物、加強藥政管理、建立廣泛的細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)絡等。通過對益生乳酸菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥機制的研究，有助于嚴謹合理地應用抗菌藥物，有助于減少益生菌耐藥性發(fā)生及傳播，有助于延長現(xiàn)有抗菌藥物的療效周期，有助于新型抗菌藥物的研發(fā)。

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