細胞培養常見問題及防控措施探討

周麗威 孫玉紅 王艷

細胞培養技術是指在動植物體外生長［1］, 并不再形成組織。培養物一般為細胞群, 也可以是單個細胞, 近年來, 其已經成為很多生物制品的主要材料, 并廣泛應用于醫學病理研究, 本文針對細胞培養存在的一些常見問題進行分析研究,并提出相應防控措施, 現總結如下。

1 CO2的濃度水平以及培養箱的衛生條件

1.1 CO2的濃度水平 常規細胞培養的過程中, 一般CO2的濃度為5%, 對于特殊細胞群則取決于培養基中的NaHCO3濃度。

1.2 培養箱的衛生條件 CO2培養箱是一個適宜細胞群落生長的模擬環境［2］, 一般情況下, 其溫度、CO2的濃度、以及酸堿度均較為恒定, 由于體外培養是細胞失去了生物體提供免疫屏障, 因此, 對其培養箱內的環境具有一定的敏感性,尤其是培養過程中的污染現象, 會為其生長帶來嚴重影響。因此, 應定期清潔培養箱, 更換無菌水盤, 在每次清潔后, 對培養箱環境因素的相關參數進行檢查, 以便及時發現污染。

2 細胞的凍存

2.1 細胞凍存液的選擇 不同種類的細胞, 其凍存液的配置也不同, DMSO具有無菌特性, 因此在使用過程中無需高壓滅菌, 反復冷凍, 進而有效降低了細胞污染的發生率。融合瘤細胞、淋巴細胞一般采用90%血清加10%DMSO, 腫瘤細胞選擇30%小牛血清加10%DMSO, 凍存液放置時間不宜過久, 最好現用現配。

2.2 凍存濃度及方法 多數細胞凍存濃度為1×106cell/ml,有特殊細胞如淋巴細胞、融合瘤細胞等凍存濃度較高, 最佳凍存濃度為5×106cell/ml, 為防止凍存管熱脹冷縮發生爆裂,因此凍存液以凍存管容量的3/4為宜。進行細胞凍存時, 應確保DMSO、血清以及培養基溫度均處于室溫水平, 收集對數生長期細胞, 并統計出數量, 按細胞種類配置凍存液, 掌握好濃度, 將細胞加入凍存液, 然后滴至凍存管, 密封擰緊凍存管。標注細胞種類、凍存的時間以及操作人員等。逐漸降溫的條件下凍存細胞, 送至儲存處。

3 細胞的復蘇

3.1 細胞的解凍 在從液氮罐取出細胞時, 操作者應做好防范凍存管爆炸的相關準備［3］, 戴上防護面具和手套, 將其取出后立即投入術中, 加快其解凍速度, 在解凍的過程中,應保證管口適當高于水面, 以防細胞被水體污染。部分細胞解凍后可直接進行培養, 一些對DMSO具有較高敏感性的細胞應進行離心處理, 更換培養液繼續培養。

3.2 血清與培養基 少數細胞對血清以及培養基的要求比較寬泛, 多數細胞對血清以及培養基具有特定要求, 因此,為確保細胞的活性, 在培養同一種細胞的過程中應盡量避免使用條件不同的培養基和血清。

4 細胞的污染以及相應處理措施

4.1 細胞污染類型 細胞污染是其培養過程中較為常見的現象, 操作不當、培養器皿未進行徹底消毒、培養環境差以及低無菌觀念等均為導致細胞污染的重要因素。因此, 提高操作人員的技術水平、定期消毒培養箱等均為有效減少細胞污染發生的有效措施。按污染類型, 細胞污染包括真菌污染、細菌污染、病毒污染以及支原體污染。正常情況下, 很多細胞群被污染后, 會阻滯生長, 產生變形, 很難處理, 而上述菌種比所培養的細胞更具活性, 培養環境也十分有利于污染物生存, 因此, 對培養箱進行定期消毒具有重要意義。

4.2 污染細胞的相應處理措施 細胞污染后, 任何補救措施均不理想, 抗生素對細胞傷害較大, 故而, 發現細胞污染,應及時對培養的細胞行滅菌操作, 然后重新培養, 對不宜丟棄的細胞可選擇廣譜抗生素抑制細菌生長, 然后于48 h內更換培養液, 但是此過程會對細胞造成不同程度的損傷, 因此更換營養液時, 應當適宜增加血清濃度, 促進細胞恢復。對于微生物導致的細胞污染, 應滅菌后丟棄, 因為殺菌后更換培養液會致使大量細胞死亡, 失去繼續培養的意義［4］。

綜上所述, 細胞培養的操作技術要求較高, 除此之外,細胞培養成功的影響因素諸多, 例如培養的溫度、酸堿度以及培養箱內的清潔情況等, 因此, 在培養細胞時, 相關操作人員應該注意細節, 遵守無菌操作原則, 盡量降低人為因素帶來的不良影響, 積極研究探索細胞培養技術, 使之滿足臨床研究需求。

［1］ 張秀敏,郭風,王凈,等.細胞培養常見問題分析及防控措施.醫學信息, 2013,24(12):248-249.

［2］ 劉嵐,陳紹坤,余紅.貼壁細胞培養過程中支原體污染的幾種救治方案療效比較研究.現代醫藥衛生, 2012,24(8):1221-1222.

［3］ 吳文亮,楊新河,章蕾,等.細胞培養中污染的防控措施.臨床合理用藥, 2011,4(1):64-65.

［4］ 周麗薇.細胞培養技術與防止細胞污染的方法.醫學信息,2012, 23(11):4587-4588.