長白山松子抗氧化肽制備及活性研究

冷帥辰，閔偉紅，*，吳丹，王明爽，劉景圣，史軍花

（1．吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118；2.小麥和玉米深加工國家工程實驗室，吉林長春130118）

研究發現，氧化應激損傷及自由基代謝失調能夠加速人體衰老，引發多種疾病[1]。而攝取足夠的抗氧化劑，能夠消除體內過多的自由基，延緩身體衰老，預防癌癥、心腦血管病和腫瘤等多種疾病的產生。與人工合成的抗氧化劑相比，酶解植物蛋白得到的抗氧化肽因其易于人體吸收、安全無副作用的特點，更受人們的青睞[2-4]。

松子（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc），主要產自中國東北、西北、西南的山林地區，其中吉林省長白山地區出產的松子質量最好[5]，其營養價值高，富含不飽和脂肪酸、蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質等。松子中蛋白質含量在30 %左右，由18 種氨基酸組成，其中必需氨基酸的含量普遍高于一般植物蛋白[6]。因此，松子蛋白不僅是良好的蛋白來源，還是一種制備多肽的優良原料。目前國內對松子的研究主要集中在松子油的提取與利用[7]，國外對松子的研究則集中在過敏原方面[8-9]，對蛋白和多肽的研究普遍較少。本試驗采用響應面分析法對酶解制備松子抗氧化肽進行工藝優化，并在此基礎上研究其抗氧化活性，為松子蛋白的充分利用和松子多肽功能性產品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

松子分離蛋白（蛋白含量89.69%）為實驗室自制。DPPH、ABTS、菲洛嗪購于sigma 公司；Alcalase 2.4 L，堿性蛋白酶購于丹麥諾維信公司，其他均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700 型紫外可見分光光度計：日本島津；SPECTRA-MAX190 型酶標儀：美國Molecular Devices公司；ZD-2 型自動電位滴定計：上海儀電科學儀器股份有限公司；BSA224S 型分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）儀器有限公司；XMTD-8222 型水浴鍋：精宏儀器公司；FD-1B-50 型冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 松子抗氧化肽制備

取松子分離蛋白粉，加入蒸餾水配成一定底物質量濃度的溶液，90 ℃下水浴10 min，破壞蛋白結構。冷卻后調節pH，加入堿性蛋白酶，電位滴定計滴加堿液維持溶液pH 恒定。酶解一定時間后，溶液經90 ℃滅酶20 min，冷卻至室溫，調節pH 至7.0，5 000 r/min 離心10 min 取上清液，冷凍干燥后得到松子抗氧化肽。

1.3.2 水解度測定

采用pH-stat 法[10]。

1.3.3 還原能力測定

根據普魯士藍反應法測定還原能力[11]。

1.3.4 響應面法優化松子抗氧化肽的酶解制備工藝

對酶解溫度、時間、加酶量、底物質量濃度和pH進行單因素試驗，根據試驗結果，篩選出4 個影響較大的因素，然后根據Box-Behnken 中心組合試驗設計原理，開展四因素三水平的響應面試驗[12]，試驗因素及水平表見表1。

表1 響應面分析因素水平表Table 1 Factors and their coded levels teasted in response surface analysis

1.3.5 羥基自由基清除能力測定

利用Fenton 反應，參照Amarowicz 的試驗方法[13]。

1.3.6 DPPH 自由基清除能力測定

參照謝正軍的試驗方法[14]。

1.3.7 ABTS 自由基清除能力的測定

參照Kong B 的試驗方法[15]。

1.3.8 Fe2+螯合能力的測定

參照Yu-Ling Lee 的試驗方法[16]。

2 結果與分析

2.1 響應面試驗

2.1.1 響應面試驗結果及分析

選取酶解溫度、底物質量濃度、加酶量、pH 四因素，酶解時間為240 min。酶解制備松籽抗氧化肽工藝的響應面分析試驗根據Box-Behnken 設計進行了29組試驗，其中5 組中心點重復試驗，結果見表2，方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression and the Analysis of Variance

以A700 為響應值回歸擬合所得各因素函數表達如下：

A700=0.72 +0.053X1-（9.667E -003）X2+0.038X3+0.064X4-（1.250E -003）X1X2-0.011X1X3-0.015X1X4-0.015X2X3+（4.250E -003）X2X4+0.022X3X4-0.041X12-0.048X22-0.040X32-0.068X42

由表3 所示，方差分析得出模型極顯著，模型的失擬性不顯著，回歸決定系數R2=0.946 7，修正決定系數R2Adj=0.893 5，說明方程擬合性較好，可以應用于對酶解條件的分析預測。根據結果進行分析：一次項X1、X3、X4極顯著，二次項X12、X22、X32、X42極顯著。說明該模型擬合程度良好，用該模型對酶解制備松籽抗氧化肽的工藝進行優化是合適的。

各因素交互作用影響還原能力的響應面圖如圖1。

如圖1 所示，直觀反映了各因素對響應值的影響，找出最佳工藝參數以及各參數之間的相互作用。

2.1.2 酶解制備松子抗氧化肽工藝條件的確定及驗證

圖1 各因素交互作用影響還原能力的響應面圖Fig.1 Response surface of mutual influence on the reducing power ability

數據分析表明回歸模型存在最大值，酶解制備松子抗氧化肽的最佳工藝條件為：酶解溫度56.43 ℃、加酶量7822.45U/g、底物質量濃度0.021 2 g/mL、pH 9.10、酶解時間240min。此條件下A700理論預測最大值為0.766。為了方便操作，選擇如下條件進行驗證試驗：酶解溫度56.5 ℃、加酶量7 822 U/g、底物質量濃度0.021 g/mL、pH 9.0、酶解時間240min。采用響應面優化條件進行酶解，所得A700值為0.753，達到預測值的98.30%。

2.2 松子抗氧化肽粗提物抗氧化活性測定

2.2.1 羥基自由基清除能力測定結果

試驗結果如圖2 所示，VC作為一種良好的抗氧化劑，在濃度為0.5 mg/mL 時清除率就能達到100%。松子抗氧化肽對羥基自由基的清除作用隨濃度的增加而顯著提高，當濃度為16 mg/mL 時，清除率到達85%以上，并在濃度為24 mg/mL 時達到100%。

2.2.2 DPPH 自由基清除能力測定結果

DPPH 自由基清除能力如圖3 所示，當VC濃度為0.1 mg/mL 時，清除率就達到91.22%。松子抗氧化肽對DPPH 自由基的清除率隨濃度的增大而升高，表現出良好的劑量關系，并在濃度為8 mg/mL 后逐漸穩定，濃度為16 mg/mL 時達到80.95%。

圖2 松子抗氧化肽對羥基自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effect of pine nut antioxidant peptide with hydroxyl radical

圖3 松子抗氧化肽對DPPH 自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of pine nut antioxidant peptide with DPPH radical

2.2.3 ABTS 自由基清除能力測定結果

ABTS 自由基清除能力如圖4 所示。

圖4 松子抗氧化肽對ABTS 自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effect of pine nut antioxidant peptide with DPPH radical

VC對ABTS 自由基清除效果顯著，濃度超過0.2 mg/mL 時清除率為100%。松子抗氧化肽對ABTS自由基的清除率隨濃度的增大不斷升高，當濃度高于4 mg/mL 時，清除效果等同于同濃度的VC，達到100%，可見松子抗氧化肽對ABTS 自由基具有很好的清除作用。

2.2.4 Fe2+螯合能力測定結果

金屬離子的存在，會加速脂質氧化的過程，測定對金屬離子的螯合能力可以衡量出樣品的抗氧化能力。試驗結果如圖5 所示。

圖5 松子抗氧化肽對Fe2+的螯合能力作用Fig.5 Ferrous ions chelating capacity of pine nut antioxidant peptide

0.5 mg/mL EDTA 能使Fe2+螯合率達到100%，而濃度為2 mg/mL 時抗氧化肽的螯合率為97.66%，4 mg/mL時達到100%。可見松子抗氧化肽與EDTA 對Fe2+均有較好的螯合能力。

3 結論

本試驗以長白山松子（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc）分離蛋白為原料，用堿性蛋白酶酶解，響應面分析法確定最佳水解工藝條件：酶解溫度56.5 ℃、加酶量7 822 U/g、底物質量濃度0.021 g/mL、pH 9、酶解時間240 min。在此條件下進行酶解，所得還原能力值能達到0.753。

對酶解制備的抗氧化肽進行活性研究，考察了羥基自由基、DPPH、ABTS 及Fe2+螯合能力4 個指標。結果表明，松子抗氧化肽隨著濃度的升高，對DPPH 的清除率最高能夠達到80.95%，對羥基自由基、ABTS 的清除率及Fe2+螯合率能夠達到100%。由此可見松子抗氧化肽對幾種自由基有顯著的清除作用，具有較強的抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有廣闊的研究價值和市場前景。

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