棕筍中酚酸類化合物的提取及抗氧化活性研究

梁華倫，江秀娟，陳地靈

（1.廣東省中醫院二沙分院藥劑科，廣州廣東510515；2.廣州市海珠區食品藥品檢驗所，廣東廣州510250；3.廣東省微生物研究所，廣東廣州510070）

棕櫚[Trachycarpus fortunei（Hook.）H.Wendl.]是中國最普遍的土生土長的棕櫚科植物，它原產中國中南部山地，是最耐寒的棕櫚，在我國長江以南地區廣泛栽培，現在世界上許多國家已有引種。棕櫚既是觀賞植物，又是經濟植物；全身（根、莖、葉、花和種子）都有用，其中含有多種化學成分，有很高的利用價值。棕筍為棕樹（Fortunes Windmill Plam）的花穗，花單性，肉質圓錐花序生于葉叢中，有明顯的大形花苞，花淡黃色而細小，初出苞的花穗花小多數密集如魚子，古稱棕筍（又名木魚）。花萼和花冠均三裂，雄蕊6 枚，子房三室，心皮基部合生，花期4～5月[1]。分布全國各地，資源豐富。《本草綱目》認為，其筍及子花，氣味：苦、澀、平，無毒。主治澀腸，止瀉痢腸風，崩中帶下。常作為菜果食用，也可制糖[2]。其含有大量酚酸類、黃酮類化合物，還含有色素類、微量元素、揮發油等成分[3]，具有多種生物活性[4-7]。本實驗就其酚酸類成分開展提取工藝篩選研究，以期為其資源的綜合開發利用提供研究基礎。

1 儀器和材料

1.1 儀器

紫外可見光分光光度計：美國Agilent8453E 型；德國Sartorius BP211D 電子分析天平（d=0.000 01 g）；XS 225A 型分析天平（d=0.000 1 g）。戴安Ultimate 3000型高效液相色譜儀（包括四元泵，自動進樣器，柱溫箱，DAD 檢測器，Chromeleon 工作站）；AR224CN 電子天平（d=0.0001 g）：奧豪斯儀器（上海）公司；SK3300LH超聲儀：托利多儀器上海有限公司；IKA RV10 HB10 basic 旋轉蒸發儀：德國IKA；HHS-4S 水浴鍋：上海宜昌儀器紗篩廠；Memmert model 100-800 烘箱：德國Memmert 公司。Acclaim C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dionex），Syncronis aQ C18（250 mm×4. 6 mm，5 μm，Thermo）；TDL-2B 離心機（Anke 公司）；ELX808 多功能酶標儀：Bio-tek，美國；Agilent8453E 型紫外可見光分光光度計：Agilent 公司，美國。

1.2 材料

棕筍于2013年2月采集江西贛州贛縣，經廣州中醫藥大學中藥學院林勵研究員鑒定為棕櫚科[Trachycarpus fortunei（Hook.）H.Wendl.]線棕的未開放花蕾。經70 ℃烘干，標本存于華南師范大學藥物研究院植物標本室（編號：ZS20130221）。沒食子酸（MUST-13040103）、原兒茶酸（MUST-12103006）、原兒茶醛（MUST-13021902）和咖啡酸（MUST-12042403）對照品均購自于成都曼斯特生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-Diphenyl-2- picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1- （2，4，6-trinitro phenyl）hydrazyl，DPPH·），Sigma Aldrich Chemical Co.（USA），批號20110304；抗壞血酸，Sigma Aldrich Chemical Co.（USA），批號20100226；三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA），天津市福晨化學試劑廠，批號20100201；硫代巴比妥酸（2-Thiobarbituric acid，TBA），aladdin chemistry co.Ltd，批號49837；液相用乙腈為色譜純；實驗用水為重蒸餾水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品溶液制備

2.1.1 對照品溶液制備

分別取干燥至恒重的沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸對照品適量，精密稱定，置25 mL 量瓶中，加20%甲醇溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得含濃度分別為0.064、0.208、0.048、0.156 mg/mL 的沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

取棕筍粉末2 g，精密稱定，加入20%乙醇25 mL，在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次，濾過，少量20 %乙醇洗滌藥渣，合并，定容到100 mL，即得供試品溶液。

2.2 總酚酸的測定

取沒食子酸對照品適量，精密稱定，于50 mL 容量瓶中，加20%甲醇溶解并稀釋至刻度，配成0.61 mg/mL的標準液，分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 沒食子酸標準液，稀釋并定容至10 mL，配制成質量濃度系列濃度的標準溶液。精確吸取上述標準溶液0.4 mL 于10 mL離心管中，加入0.2 mol/L FC 試劑1 mL、15%Na2CO3溶液2 mL，蒸餾水定容至8 mL，25 ℃反應2 h。另精確吸取20%乙醇0.4 mL，同法操作作為空白對照。在765 nm波長處測量其吸光度。繪制吸光度與濃度的標準曲線，并擬合線性回歸方程，A=1.425 8C+0.034 9，r=0.999。線性范圍0.122 0 mg/mL～0.610 0 mg/mL。

2.3 4 種酚酸類成分的含量測定

色譜條件，Acclaim C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Dionex）色譜柱，流動相乙腈-0.4%磷酸水，梯度洗脫，柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min，檢測波長275 nm。并參照文獻[9]進行線性關系、精密度、穩定性、重復性和加樣回收率等方法學考察試驗。結果沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸在棕筍中均能達到很好的分離，見圖1，同時方法學考察試驗結果顯示均符合要求。

圖1 棕筍對照品和樣品HPLC 圖譜Fig.1 Chromatograms of the four mixed reference standards and the sample of the buds of T.fortunei

2.4 單因素考察試驗

2.4.1 料液比對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比分別為10、20、30、50 倍（g/mL）加入50%乙醇，在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。濾過，少量50%乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，0.4 mL 于10 mL 離心管中，照“2.2”項下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項下方法，測定4 種酚酸類成分含量，結果見圖2。

圖2 料液比對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.2 Effects of ratio of liquid to solid on extraction of the buds of T.fortunei

實驗結果，如圖2 顯示，不同料液比的棕筍酚酸類成分提取率無顯著性差異（p＞0.05），從環保和節能角度出發，選擇料液比10 倍量。

2.4.2 乙醇濃度對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比10 倍，分別加入10 %、30 %、50 %、70 %、100 %乙醇（ν ∶ν），在80 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。濾過，少量相應濃度乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”項下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項下方法，測定4 種酚酸類成分含量，結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.3 Effects of concentration of alcohol on extraction of the buds of T.fortunei

從圖3 中可以看出，隨乙醇濃度的升高，酚酸類成分提取率逐漸增大，當乙醇體積分數達到50%時，提取率達到最大，往后隨著醇濃度的加大，酚酸類成分提取率變化不大。

2.4.3 提取時間對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比10 倍加入50%乙醇，在80 ℃水浴中分別浸提15、30、45、60、75、90 min，提取2 次。濾過，少量50%乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”項下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項下方法，測定4 種酚酸類成分含量結果見圖4。

圖4 提取時間對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.4 Effects of extracting times on extraction of the buds of T.fortunei

提取時間考察試驗結果表明，棕筍酚酸類成分提取率隨提取時間的延長而增大，并在30 min 時提取率達到最大，繼續延長時間，提取率基本保持不變。

2.4.4 提取溫度對棕筍酚酸類成分提取率的影響

取棕筍粉末2 g，精密稱定，按料液比10 倍加入50%乙醇，分別在30、50、70、90 ℃水浴中浸提30 min，提取2 次。濾過，少量50%乙醇洗滌藥渣，合并，定容到200 mL，照“2.2”項下方法，在765 nm 波長處測量其吸光度，計算總酚酸類成分提取率；照“2.3”項下方法，測定4 種酚酸類成分含量，結果見圖5。

圖5 提取溫度對棕筍酚酸類成分提取率的影響Fig.5 Effects of extracting temperature on extraction of the buds of T.fortunei

實驗結果表明，棕筍酚酸類成分提取率隨提取溫度的升高而增大，并在50 ℃達到最大，隨后提取率隨溫度升高基本不變。

2.5 正交試驗

采用L9（34）正交表進行試驗設計，結合單因素試驗結果，進一步考察乙醇濃度（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）對棕筍酚酸類成分提取率的影響，以總酚酸提取率（T1）和4 種酚酸類成分總含量（T2）各占50%為考核指標，確定最佳提取工藝。因素與水平見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗結果與直觀分析Table 2 Result of L9（34）orthogonal experiment and analysis

結果如表2 所示，方差分析結果見表3。

表3 L9（34）正交實驗方差分析表Table 3 ANOVA analysis of L9（34）orthogonal experiment

由表2 可知，影響棕筍酚酸類成分提取的主次因素為B＞C＞A，即提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度。從表3 可知各因素對棕筍酚酸類成分提取率的影響均未達到顯著水平，其最佳提取工藝條件應為A1B2C2，即乙醇濃度50%、溫度50 ℃、每次提取30 min、提取2 次。

2.6 驗證試驗

按上述最佳提取工藝對棕筍酚酸類成分進行5次實驗，結果5 次實驗得到提取液中總酚酸類成分平均含量為50.79 mg/g，RSD%=1.26，4 種成分總量為6.35 mg/g，RSD%=1.25，說明最佳工藝條件穩定可靠，結果見表4。

表4 驗證試驗結果Table 4 The results of verifying test

2.7 抗氧化活性測定

2.7.1 DPPH 法測定抗氧化能力[8]

準確移取樣品待測液2.0 mL，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 溶液（取適量DPPH 固體溶解于80 %乙醇的50 mmol/L Tris-HCl 溶液中），混勻，放置一段時間，以無水乙醇調零，測定517 nm 波長處的吸光度，記為A樣品。準確移取樣品待測液2.0 mL 與無水乙醇2.0 mL，混勻，放置一段時間，在517 nm 處的吸光度，記為A對照。準確移取DPPH 溶液2.0 mL 與無水乙醇2.0 mL，混勻，在517 nm 波長處的吸光度，記為A空白，按下公式計算DPPH 清除率：

2.7.2 清除·OH 能力測定-脫氧核糖法[9]

取1.5 mL 反應液（0.1 mmol/L EDTA，0.1 mmol/L FeCl3，2.8 mmol/L 脫氧核糖），先后加入0.1 mL 抗壞血酸（1 mmol/L），0.35 mLH2O2（20 mmol/L），37 ℃水浴30 min。上述混合液加入1 mL 樣本溶液再次37 ℃水浴30 min，隨后依次加入0.3 mL TBA（0.2 mmol/L）和1 mL TCA（0.06 mmol/L）100 ℃水浴15 min，532 nm 處測定吸光值A1（以蒸餾水代替TBA 作為空白調零），同時用1 mL 蒸餾水代替樣本溶液時的吸光度A0作為陰性對照。

2.7.3 Fe2+絡合能力測定

取1 mL 不同質量濃度樣品溶液（0～40 mg/mL）與3.7 mL 甲醇和2 mmol/L FeSO4·7H2O 0.1 mL 混合，反應30 s 后，加入5 mmol/L 亞鐵嗪0.1 mL，混合均勻后室溫下反應10 min，在波長562 nm 處測得樣品吸光度。以樣品本身溶劑為空白樣本，每個樣品平行3 次，取平均值。

式中：A0為空白樣本吸光度；A樣為樣品吸光度。

本實驗結果顯示，見表5。

表5 棕筍中總酚酸類成分的抗氧化活性結果Table 5 The values of IC50 of extracts from the buds of T.fortunei（mean±SD，n=3）

棕筍總酚酸提取物清除DPPH 的IC50為0.69±0.02，清除DPPH 的IC50為0.56±0.01，絡合Fe2+的IC50為0.84±0.03，約為維生素C 抗氧化能力的一半，由此可見，其抗氧化能力較強。

3 討論

棕櫚在我國長江以南地區廣泛栽培，棕櫚既是觀賞植物，又是經濟植物；全身（根、莖、葉、花和種子）都有用，其中含有多種化學成分，有很高的應用價值。棕苞一般從每年的11月份到次年的3月份可以采摘，剝去外層棕皮即可取得。棕苞味甘微苦，口感較好，具有降血壓和清涼解暑的作用，含有多種氨基酸、淀粉、失水乳糖和蔗糖等，是山珍食譜中的佼佼者。但對于其的開發利用還不夠。因此，本文通過正交試驗，確定了棕筍中總酚酸的最佳提取工藝條件應為乙醇濃度50 %、溫度50 ℃、每次提取30 min、提取2 次，其提取率可達50.79 mg/g。經驗證實驗證明，本提取工藝穩定可靠，可作為棕筍中酚酸類化合物的提取工藝。

近年來，氧化應激給動物細胞和組織帶來的危害成為人們關注的熱點，其機制是氧分子失去了外圍電子形成的自由基會奪取其他細胞分子的外圍電子，使自身保持穩定，造成一種連鎖反應，使機體組織細胞分子受到損害。因此，研究天然抗氧化物，從根本上預防自由基氧化損傷迫在眉睫。植物多酚作為新型飼料添加劑成為國內外動物營養學界的一個研究熱點。植物多酚是廣泛存在于植物體內的天然產物，是植物的次生代謝產物，具有獨特的生理活性和藥用價值，多酚具有較強的清除自由基、抗氧化活性、抗衰老等生物活性功能。酚羥基極易被氧化成為醌類而提供氫，棕筍中具有的多酚類結構化合物中具有連或鄰酚基，作為抗氧化劑其活性高于一般的非酚類或単酚基類抗氧化劑。本實驗所檢測到的沒食子酸、原兒茶酸、原兒茶醛和咖啡酸均為多酚類化合物，因此，棕筍可作為抗氧化劑開發原料。隨著棕櫚研究的深入，相信棕櫚綜合利用和開發一定會有很好的廣闊前景。

[1] 曹紅星,吳翼.棕櫚科植物現狀及展望[J]. 江西農業學報, 2008(12):52-54

[2] 胡建湘.棕櫚的利用—棕櫚糖[J].科普旅游,2008(1):20

[3] 楊醫亞.中醫學[M].北京:人民衛生出版社,1999:30-41

[4] 王清,辛勤,李軍,等.棕櫚花蕾提取液對大鼠回腸平滑肌收縮活動的影響[J].濟寧醫學院學報,2005,28(4):5-6

[5] 劉善庭,王清,李健美,等.3 種棕櫚花蕾提取液對大鼠離體子宮平滑肌作用的比較研究[J].中國中醫藥科技, 2003, 10(4):228-229

[6] 齊汝霞,王清,張鵬,等.棕櫚花蕾水提液對兔離體腸平滑肌作用的影響[J].中國民族民間醫藥雜志,2006(79):115-116

[7] 盧汝梅,張宏建,李兵,等.棕櫚花蕾提取物對小鼠離體子宮平滑肌收縮功能的影響[J].中國民族民間醫藥雜志,2009(11):56-57

[8] Cardador-Martinez,A, Loarca-Pina,G, Oomal,B D. Antioxidant activity in common beans(Phaseolus vulgaris L.)[J]. J Agri＆Food Chem,2002,50(24):6975-6980

[9] Nagai T, Myoda T, Nagashima T: Antioxidative activities of water extract and ethanol extract from field horsetail(tsukushi) Equisetum arvense L.[J].Food Chem,2005,91(3):389-394