氣相色譜外標法測定南極磷蝦油中的EPA和DHA含量

汪勝福，劉建君，門敬菊，郭忠，馮迪娜，朱曉麗，張慶香

（1.遼寧省大連海洋漁業集團公司技術中心，遼寧大連116113；2.中國人民解放軍第210醫院臨床藥理基地，遼寧大連116011）

南極磷蝦（Antarctic krill）學名Euphausia superba，屬于動物界節肢動物門，甲殼亞門軟甲綱、磷蝦目、磷蝦科。分布區域在南極磷蝦棲息在南極輻合區以南的南極海域里。南極磷蝦富含蛋白質、磷脂、蝦青素、甲殼素、酶等營養成分與活性成分；南極磷蝦中的脂類相比于蛋白質來說含量較少，但磷蝦脂類中，以極性脂含量最高，甘油三酯次之，分別為總脂肪的56 %～81%和12%～38%。南極磷蝦脂類所含的脂肪酸種類多，且多為不飽和脂肪酸，尤其EPA 和DHA 含量較高[1]。EPA 和DHA 是根據它們化學結構含碳的多少，也叫二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸。EPA 和DHA 是組成磷脂、膽固醇酯的重要脂肪酸。EPA、DHA 的體內來源是α-亞麻酸。α-亞麻酸進入人體后，在同一種去飽和酶的作用下，在人體中衍生為EPA 和DHA，α-亞麻酸和EPA 與DHA 均屬于Omega-3 脂肪酸[2]。許多科學家研究證明：Omega-3 有益于預防和治療冠心病、糖尿病、類風濕、皮炎、癌癥、抑郁癥、神經分裂癥、癡呆、過敏、哮喘、腎病和慢性阻塞性肺病等[3-4]。故而，南極磷蝦近年來引起國內外廣泛重視。隨著消費者需求量不斷增加，大規模提取工藝不斷優化，其中有效成分EPA、DHA 含量存在較大差異，因此，建立南極磷蝦油產品中EPA 與DHA 的快速客觀準確的檢測方法，對于當前南極磷蝦研究與質量控制均具有極其重要的意義。另一方面，油脂中脂肪酸的測定通常需要甲酯化處理，常用的甲酯化方法有三氟化硼法、三甲基氫氧化硫（TMSH）法、甲醇鉀法、重氮甲烷、鹽酸/甲醇、硫酸/甲醇和氫氧化四甲胺/甲醇等[5]。本研究通過KOH-甲醇、硫酸-甲醇的回流甲酯化方法，與GB 28404-2012《食品安全國家標準保健食品中α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的測定》標準上的甲酯化方法[7]，進行針對性檢測南極磷蝦油制品中的EPA 與DHA 的含量對比，優選出具有操作簡單、快捷、客觀準確的方法。

1 材料與方法

1.1 試樣及試劑

南極磷蝦油：遼寧省大連海洋漁業集團公司；EPA/DHA 甲酯標準品（純度≥99%）：美國SIGMA 公司；異辛烷、正己烷、甲醇均為色譜純；氫氧化鉀、濃硫酸為分析純；2 mol/L KOH-甲醇溶液、2 mol/L 硫酸-甲醇溶液：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器設備

7820A 型氣相色譜儀（附氫火焰離子化檢測器）：美國Agilent 公司；AL204 型電子天平（0.1 mg）：梅特勒-托利（Metter Toledo）公司；TGL-16M 型高速臺式冷凍離心機：長沙湘智離心機儀器公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：HP-88 型石英毛細管柱，100 m×0.250 mm×0.20 μm；色譜柱溫度：210 ℃恒溫20 min，以3 ℃/min 升溫至240 ℃，維持20 min；進樣口溫度：260 ℃；FID 檢測器溫度：260 ℃；進樣方式：分流，分流比10 ∶1；進樣量：1 μL；載氣：高純氮氣（99.99%）。

1.4 方法

1.4.1 標準溶液制備

DHA 甲酯、EPA 甲酯標準液：均用正己烷配制成濃度為0.040 mg/mL、0.080 mg/mL、0.100 mg/mL、0.200 mg/mL、0.400 mg/mL、0.800 mg/mL、1.000 mg/mL 的標準工作液，臨用時配制。

1.4.2 樣品制備[5]

堿酸法：稱樣0.5 g 左右到錐形瓶中，加10 mL KOH-甲醇溶液，100℃下冷凝回流5min，放涼。加10mL硫酸甲醇溶液，100 ℃下冷凝回流5 min，放涼至30 ℃～40 ℃。加5 mL 異辛烷，保持30 ℃～40 ℃振搖30 s 提取。立即加入25 mL 飽和氯化鈉溶液充分振搖，放涼至室溫，靜置分層，吸取有機相于10 mL 離心管中，經3 000 r/min 離心5 min，進樣。

GB28404 法[7]：稱取混合均勻的油類制品0.2 g～1 g至25 mL 容量瓶中，加入5 mL 正己烷輕搖溶解，并用正己烷定容至刻度，搖勻。吸取上述溶液3.0mL 至10mL至具塞刻度試管中，加入3.0 mL 氫氧化鉀甲醇溶液，立即移至渦旋混合器上振蕩混合5 min，靜置5 min，加入6 mL 蒸餾水，上下振搖0.5 min，靜置分層后，吸取下層液體，棄去后再反復用少量蒸餾水進行洗滌，并用吸管棄去水層，直至洗至中性（若有機相有乳化現象，以4 000r/min 離心10min），吸取正己烷層待上機測試用。

1.4.3 結果計算

對所得的色譜圖，以外標法、歸一化法進行結果計算：

式中：Xi 為試樣中EPA、DHA 的含量，（mg/g）；Ci為由標準曲線查得測定樣液中各脂肪酸甲酯的濃度，（mg/mL）；V 為被測定樣液的最終定容體積，mL；m 為試樣的稱樣質量，g；F 為各脂肪酸甲酯轉化為脂肪酸的換算系數，EPA 甲酯轉化為EPA 脂肪酸的轉換系數為0.955 7；DHA 甲酯轉化為DHA 脂肪酸的轉換系數為0.959 0；

歸一化法：由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產生信號，得到相應的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。

2 結果與討論

2.1 EPA 甲酯和DHA 甲酯的色譜分離

利用優化好的氣相色譜分離條件，首先對EPA/DHA 甲酯標準品進行了分離，其色譜圖見圖1a。

由圖1a 可見，EPA 甲酯、DHA 甲酯的保留時間分別為27.683 min、35.878 min，二種脂肪酸甲酯分離良好。

對南極磷蝦油樣品進行分離，其圖譜見圖1b。從圖1b 可以看出，EPA，DHA 兩個組分得到分離，并且其余組分不干擾測定。

圖1 EPA 甲酯、DHA 甲酯標準品（a）與南極磷蝦油樣品（b）的氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatograph of EPA ester，DHA ester standards（a）and a sample of antarctic krill oil（b）

2.2 外標法擬合標準曲線方程

對不同濃度的EPA 甲酯、DHA 甲酯標準液進行色譜分析，并以得到的色譜峰面積對濃度作圖，可以得到兩者的曲線方程如表1，可以看出兩者都滿足要求（R2＞0.995）。

表1 EPA 甲酯、DHA 甲酯的標準曲線方程與相關系數Table 1 EPA methyl ester DHA standard curve and the correlation coefficients

2.3 EPA 和DHA 的回收率

在100 mg 的南極磷蝦油樣品中分別精確加入一定量的EPA 和DHA，按2.4.2（堿酸法）所述步驟測定，2.4.3 定量分析，進樣次數為5 次，測定結果見表2。

2.4 外標法和峰面積歸一化法對結果影響

取同一南極磷蝦油樣品（20121101YA004-5P 批）5 份，按2.4.2（堿酸法）所述步驟測定，2.4.3 定量分析，得EPA 和DHA 的精密度，結果見表3、表4；對情況來看，外標法測得數據相對標準偏差小、重現性好，對南極磷蝦油的提取工藝優化與檢測更具有意義，見表5。

表2 EPA 和DHA 的加標回收率及其精密度（n=3）Table 2 Recoveries and precisions（RSDs）of EPA and DHA spiked in Samples（n=3）

表3 南極磷蝦油樣品中EPA 和DHA 的分析精密度（外標法n=6）Table 3 The precisions of EPA and DHA in antarctic krill oil（External Standard Method n=6）

表4 南極磷蝦油樣品中EPA 和DHA 的分析精密度（歸一化法）Table 4 The precisions of EPA and DHA in antarctic krill oil（Normalization Method n=6）

表5 外標法和峰面積歸一化法的結果對比Table 5 The comparison results of external standard method and peak area normalization method

2.5 對比GB 28404-2012 法測定

取同一南極磷蝦油樣品（20121101YA004-5P 批）5 份，按2.4.2（GB28404 法）所述步驟測定，按照2.4.3所述步驟定量分析，得EPA 和DHA 的結果，見表6。

表6 國標法測得南極磷蝦油中EPA、DHA 含量的結果Table 6 The content results of EPA and DHA in antarctic krill oil by national standard（GB 28404）

通過甲酯化方法的對比，堿酸法進行甲酯化比較完全，而GB 28404 法甲酯化程度不夠完全，致使外標法EPA、DHA 含量測定比較低，偏低幅度分別為EPA：6.6%，DHA：11.4%，而歸一化法測得數據基本在10%的誤差范圍內；歸一化法由于受樣品本身固有物質屬性與甲酯化處理方法甲酯化率的制約，稱取的樣品中含有一定量的未甲酯化的成分，以及色譜柱分離條件的限制，致使有一些峰達不到理想的分離效果，峰面積積分存在難以避免的偏差，這些因素致使測定的EPA、DHA 含量不夠客觀準確。而外標法是氣相色譜當中一種比較理想的定量方法，它要求標準品純度達到要求，對操作條件要求不高，被公認為是測定脂肪酸含量的方便、準確的定量方法之一。

3 結論

本實驗采取堿酸法對脂肪酸進行回流甲酯化，甲酯化程度高，用外標法測定EPA、DHA 含量，此方法操作簡便快速，易消除干擾，避免了其他方法對EPA、DHA 不飽和脂肪酸成分進行測定時采取所有甲酯化脂肪酸達到分離度的不必要麻煩，該方法在準確性、線性、重現性、回收率等方面均達到滿意結果。

[1] 劉麗,劉承初,趙勇,等.南極磷蝦的營養保健功效以及食用安全性評價[J].食品科學,2010,31(17):443-447

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[5] 國家質量監督檢驗檢疫總局, 國家標準化管理委員會.GB/T 17376-2008/ISO 5509:2000. 動植物油脂 脂肪酸甲酯制備[S].北京:中國標準出版社,2009

[6] 吳偉都,金世梅,朱慧.氣相色譜內標法測定奶粉及乳飲料中的DHA 和EPA[J].中國食品添加劑,2005(1):106-108

[7] 中華人民共和國衛生部．GB 28404-2012 食品安全國家標準保健食品中α-亞麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的測定[S]．北京:中國標準出版社,2012