反相高效液相色譜法測(cè)定綠茶中綠原酸

張英，饒長(zhǎng)全

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東深圳518055）

綠茶作為未發(fā)酵茶，保留了茶葉中最原有的化學(xué)成分，綠原酸是綠茶中具有藥用功效的化學(xué)成分[1]。綠原酸是多酚類物質(zhì)，因綠茶的制作工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，未經(jīng)過(guò)多次晾曬、加熱處理，所含茶多酚受破壞較少，茶多酚含量比其他種類茶葉含量要高[2]。綠原酸具有抗菌、抗病毒、止血和抗肝炎的作用，對(duì)葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌都有抗菌作用[3-5]，對(duì)上呼吸道感染致病病毒有抑制作用[6-7]；對(duì)肝癌、肺癌、皮膚癌和消化道癌有預(yù)防作用[8-9]；綠原酸分子中的活性羥基可以形成具有抗氧化作用的氫自由基，可以保護(hù)膠原蛋白不受活性氧等自由基傷害，有效防止紫外線對(duì)人體皮膚產(chǎn)生傷害作用[10-13]。文獻(xiàn)中采用沸水提取法提取茶中綠原酸成分，乙腈磷酸水溶液為流動(dòng)相的高效液相色譜法定量分析茶中綠原酸的含量[14-15]。綠原酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)使其在水中溶解度僅為4%（25 ℃）[16]，沸水提取條件無(wú)法更好地提取出茶中的綠原酸。為此，本實(shí)驗(yàn)討論了乙醇提取綠茶中綠原酸的條件、考察了不同產(chǎn)地綠茶綠原酸含量的差異，建立了甲醇醋酸水溶液為流動(dòng)相的高效液相色譜法定量分析綠茶中綠原酸的含量，為綠茶在化妝品、保健品等行業(yè)的應(yīng)用研究，促進(jìn)綠茶的深加工提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶為市售產(chǎn)品。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；色譜純甲醇：天津市協(xié)和吳鵬科技有限公司；乙醇、三氯甲烷分析純?cè)噭簭V州化學(xué)試劑二廠；超純水；流動(dòng)相經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，超聲脫氣后使用。

1.2 儀器與設(shè)備

美國(guó)Agilent 公司1100 系列高效液相色譜儀，由四元低壓泵、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器及自動(dòng)進(jìn)樣器組成；日本島津UV-2401PC 型分光光度計(jì)；Millipore-Q 超純水系列；TGL-16G 高速離心機(jī)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，加適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻，得1.000 mg/mL 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液。冷藏避光保存，按需稀釋成不同質(zhì)量濃度以待分析。

1.3.2 樣品溶液的制備

將干燥茶葉樣品粉碎后過(guò)50 目篩（3 號(hào)篩），準(zhǔn)確稱取茶葉樣品粉末0.5 g，置于平底燒瓶中，分別加入50%的乙醇50.00 mL，準(zhǔn)確稱定質(zhì)量。100 ℃提取，加熱60 min，冷卻后，加乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量。5×103r/min離心分離提取液5 min，精密吸取上清液25.00 mL，水浴濃縮約1 mL 左右，加入30 mL 水溶解成樣品提取水溶液。將上述樣品提取水溶液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，分別用25 mL 的氯仿萃取3 次，棄去氯仿層，水層水浴蒸干，用甲醇定容至10.00 mL，搖勻。用0.45 μm 微孔濾膜抽濾，并轉(zhuǎn)移至2 mL 進(jìn)樣瓶中，待用。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Waters 公司產(chǎn)symmetryC18 柱（150mm×4.6mm i.d，填料粒度為5 μm）。流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸（20 ∶80 ∶0.5）；流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm，柱溫30 ℃；光電二極管陣列檢測(cè)器。在此條件下，樣品中綠原酸達(dá)到基線分離。

1.3.4 樣品測(cè)定

將處理后的樣品提取液進(jìn)行液相色譜分析，進(jìn)樣量為5 μL，采用外標(biāo)法定量。

1.3.5 正交試驗(yàn)確定乙醇提取法最佳條件

為研究乙醇提取法對(duì)綠茶中綠原酸提取量的影響，并獲取最佳提取條件，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。以乙醇提取液濃度（A）、水浴溫度（B）和提取時(shí)間（C）為影響因素，以綠原酸提取量為指標(biāo)，采用三因素三水平的正交表以L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，各因素和水平選取結(jié)果如表1 所示。

表1 L9（34）正交因素水平表Table 1 L9（34）factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取1.3.1 制得的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品母液用甲醇稀釋至0.010 0 mg/mL，通過(guò)紫外分光光度計(jì)在200 nm～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，圖1 顯示了綠原酸的分子結(jié)構(gòu)和最大紫外吸收波長(zhǎng)。結(jié)合色譜條件驗(yàn)證確定色譜分析測(cè)定波長(zhǎng)在328 nm 處可以使色譜峰的響應(yīng)值最大，基線平穩(wěn)。

圖1 綠原酸分子結(jié)構(gòu)和紫外吸收曲線Fig.1 Chlorogenic acid molecular structure and UV absorption diagram

2.2 流動(dòng)相的選擇

綠原酸為有機(jī)弱酸（如圖1 所示），在色譜分析中由于有機(jī)弱酸的電離而導(dǎo)致色譜峰的擴(kuò)散和拖尾，影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。控制流動(dòng)相酸度可以抑制綠原酸酚羥基解離，防止色譜峰拖尾現(xiàn)象的出現(xiàn)。目前文獻(xiàn)報(bào)道中采用液相色譜法測(cè)定植物綠原酸含量的方法中，流動(dòng)相多采用乙腈水溶液添加磷酸或乙酸[14-15]，可以很好地分離綠原酸，但是樣品保留時(shí)間偏長(zhǎng)，色譜用乙腈購(gòu)買(mǎi)成本也比甲醇高。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水-冰醋酸（20 ∶80 ∶0.5）作為流動(dòng)相，在流速1.0 mL/min條件下很好地抑制了色譜峰拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，綠原酸達(dá)到基線分離，并且可以縮短分析時(shí)間，降低分析成本。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（a）和廣西綠茶樣品的色譜圖（b）見(jiàn)圖2。

圖2 綠原酸的HPLC 色譜圖Fig.2 Chromatogrames of chlorogenic acid

從圖2 中可以看出，廣西綠茶在保留時(shí)間為9.5 min 時(shí)，存在綠原酸的吸收蜂，此吸收峰與其他干擾峰分離效果好。

2.3 乙醇提取法最佳條件的研究

以廣西綠茶為樣品，根據(jù)本文1.5 所示正交試驗(yàn)方法對(duì)綠原酸最佳提取條件進(jìn)行了討論，試驗(yàn)結(jié)果采用極差分析法進(jìn)行分析，正交試驗(yàn)方案與結(jié)果如表2 所示。

表2 綠原酸最佳提取條件試驗(yàn)方案及結(jié)果分析Table 2 Results and ideal plannings of extract condition of chlorogenic acid in green tea

從表2 結(jié)果分析得出，各因素對(duì)綠原酸提取量影響的大小順序是：提取溫度﹥乙醇提取液濃度﹥提取時(shí)間，從分析結(jié)果看出最佳提取條件為A2B3C2，即為50%乙醇提取液濃度，100 ℃提取溫度和60 min 提取時(shí)間。稱取0.5 g 廣西綠茶3 份，在最優(yōu)條件下進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)，所得廣西綠茶綠原酸平均提取量為6.199 mg/g。

2.4 線性范圍考察

取1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品母液用甲醇稀釋成80.0、40.0、20.0、10.0、5.00、2.50、1.00、0.50、0.25 μg/mL 的系列綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。分別轉(zhuǎn)移至2 mL 進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣5 μL，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為y=6 971.2x-6.44，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6（n=5）。結(jié)果表明：在0.25 μg/mL～80.0 μg/mL 濃度范圍內(nèi)綠原酸有著良好的線性關(guān)系，可以很好的測(cè)定綠原酸的含量。當(dāng)信噪比（RSN）為3 時(shí)，測(cè)得綠原酸的檢測(cè)限（LOD）為0.03 μg/mL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按1.3.3 色譜條件進(jìn)樣5 μL，重復(fù)進(jìn)樣5 次，測(cè)得綠原酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.31%，表明該方法測(cè)定綠原酸儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

廣西綠茶提取物的供試品溶液在制備0、2、8、12、24 h 后，按1.3.3 色譜條件分別進(jìn)樣5 μL，測(cè)得綠原酸峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.21%，說(shuō)明廣西綠茶提取物的供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取同一份廣西綠茶樣品5 份，按1.3.2 所示樣品溶液制備方法制備供試品溶液，按1.3.3 色譜條件進(jìn)樣5 μL，測(cè)得綠原酸平均含量為6.199 mg/g，RSD為1.11%。說(shuō)明該方法的重復(fù)性達(dá)到了分析的要求。

2.5.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)回收法進(jìn)行回收率考察。精密稱取同一份已知綠原酸含量的廣西綠茶樣品0.3 g，分別稱取5份，精密加入1.3.1 配制的1.000 mg/mL 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.00 mL，放置24 h，然后按照1.3.2 所示樣品溶液制備方法制備供試品溶液，按1.3.3 色譜條件進(jìn)樣5 μL，根據(jù)加入綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量與檢出質(zhì)量計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 綠原酸加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table 3 Average recovery for chlorogenic acid in spikes green tea（n=5）

表3 顯示結(jié)果表明，平均加標(biāo)回收率為96.8%，加標(biāo)回收率在95.7%～98.2%之間，RSD 為0.98%；表明本方法回收率較好，分析方法準(zhǔn)確可靠。

2.6 茶葉樣品的測(cè)定

選用不同產(chǎn)地不同品種的綠茶，每個(gè)樣品平行制備三組樣品，測(cè)定樣品中綠原酸含量，測(cè)得的結(jié)果如表4 所示。

表4 綠原酸含量測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Contents of chlorogenic acid in green tea（n=3）

通過(guò)表4 顯示的結(jié)果可知：不同產(chǎn)地的綠茶，由于土壤、氣候、光照濕度等因素的差異，導(dǎo)致茶葉中綠原酸含量存在差異。廣西綠茶的綠原酸含量最高為6.199 mg/g，杭州龍井的綠原酸含量最低為2.438 mg/g。

2.7 過(guò)期茶葉樣品的測(cè)定

選用過(guò)期3年的廣西綠茶，每個(gè)樣品平行制備3組樣品，測(cè)定樣品中綠原酸平均含量為4.162 mg/g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)確定了50 %乙醇、100 ℃提取溫度和1 h提取時(shí)間為綠原酸最佳提取條件，對(duì)6 種不同產(chǎn)地綠茶中綠原酸進(jìn)行了提取，并達(dá)到滿意效果。結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定，色譜柱為Waters 公司產(chǎn)symmetry C18 柱（150 mm×4.6 mm i.d，填料粒度為5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸（20 ∶80 ∶0.5），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為328 nm，柱溫30 ℃。在此條件下，抑制了色譜峰拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)，使綠原酸達(dá)到基線分離，縮短了分析時(shí)間，降低了分析成本。通過(guò)外標(biāo)法定量，得出不同產(chǎn)地的綠茶中，廣西綠茶的綠原酸含量最高為6.199 mg/g，杭州龍井的綠原酸含量最低為2.438 mg/g。過(guò)期了3年的廣西綠茶中含有4.162 mg/g 綠原酸。產(chǎn)地、栽培環(huán)境對(duì)綠茶生長(zhǎng)的影響，會(huì)造成其中綠原酸的含量差異。儲(chǔ)存時(shí)間也會(huì)對(duì)其綠原酸含量產(chǎn)生影響。

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