脫基因毒性乳酸菌的篩選

張明，孫二娜

（1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京100048；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院教育部功能乳品實(shí)驗(yàn)室，北京100083；3.食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048；4.北京工商大學(xué)北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048）

基因毒性是指能直接或間接損傷DNA 的性質(zhì)。基因毒性化合物直接或間接損傷細(xì)胞DNA，產(chǎn)生致突變或致癌作用的物質(zhì)。4-硝基喹啉-1-氧化物（4-Nitroquinolin 1-oxide）是一種硝基芳烴類化學(xué)誘變劑和致癌物質(zhì)。由于環(huán)境中多環(huán)芳烴化合物的不完全燃燒和氮的氧化，硝基芳烴在自然界中廣泛存在，并能夠引起人類及動物細(xì)胞的基因突變[1-2]。

乳酸菌能夠通過對基因毒性物質(zhì)的吸附或轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)脫除基因毒性的目的[3]。乳酸菌對于基因毒性物質(zhì)的脫除作用也是乳酸菌預(yù)防癌癥的重要因素之一[4-5]。然而，不同種類的乳酸菌脫除基因毒性的活性有很大的不同[6-7]。Cenci 等用SOS 顯色反應(yīng)檢測了分離自乳制品的乳酸菌對4-NQO 的基因毒性抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)67 株乳酸菌中有31 株菌對4-NQO 的脫基因毒性能力大于75%，抑制能力最強(qiáng)的菌株有：干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌等[7]。

本研究以6 個種屬（干酪乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌）的55 株乳酸菌為基礎(chǔ)，篩選具有脫基因毒性的菌株，并分析脫基因毒性作用與菌種之間的聯(lián)系。并對具有良好脫毒效果的菌株進(jìn)行量效關(guān)系測定，探究各菌株脫毒能力與劑量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌種

本實(shí)驗(yàn)所用乳酸菌均由北京市教育部共建功能乳品實(shí)驗(yàn)室分離及保藏，共55 株。其中干酪乳桿菌5株，植物乳桿菌9 株，保加利亞乳桿菌11 株，唾液乳桿菌9 株，雙歧桿菌9 株，發(fā)酵乳桿菌11 株，鼠李糖乳桿菌1 株。

1.2 試劑

4-硝基喹啉氧化物（4-NQO）：間接致癌物，用二甲基亞砜將4-NQO 配成50 mmol/L 的溶液，-20 ℃凍存，用時使用二甲基亞砜稀釋至所需濃度。

4-羥胺基喹啉氧化物（4-HAQO）：4-NQO 的直接致癌形式，微生物可通過自身的生物轉(zhuǎn)化將4-NQO完全轉(zhuǎn)化為4-HAQO。用二甲基亞砜將4-HAQO 配成50 mmol/L 的溶液，-20 ℃凍存，用時使用二甲基亞砜稀釋至所需濃度。

1.3 菌株的培養(yǎng)

乳酸菌菌種保藏狀態(tài)部分為凍干粉，部分保藏于脫脂甘油中。干粉狀態(tài)菌種活化時，在無菌條件下，抽取部分MRS 培養(yǎng)基加入干粉瓶中，形成菌懸液。抽取菌懸液加入MRS 培養(yǎng)基中。保藏于脫脂甘油中的菌，按1%比例接入MRS 培養(yǎng)基中，進(jìn)行活化。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。而后按1%接種量傳代培養(yǎng)。使用第3 代菌株作為實(shí)驗(yàn)用菌。

將各乳酸菌菌株的第三代菌株培養(yǎng)12 h，培養(yǎng)液進(jìn)行離心，菌體沉淀用生理鹽水洗滌，再次離心，菌體重懸在生理鹽水中制成菌懸液。取2 mL 菌懸液加4-NQO 稀釋液制成菌體4-NQO 共培養(yǎng)物，菌體濃度1010cfu/mL 左右，4-NQO 終濃度5 mM/L。共培養(yǎng)體系橫置于振蕩培養(yǎng)箱中，在避光條件下震蕩培養(yǎng)4 h，離心取1 mL 上清液于離心管中，再次離心（10 000 r/min，2 min）。吸取上清液，進(jìn)行HPLC 分析。

1.4 HPLC 檢測程序[8]

流動相：A 相為超純水，B 相為乙腈。濃度梯度：0 min～20 min，B 相濃度10%～30%，21 min～25 min B相濃度維持90%。總流速：1 mL/min。檢測波長：355 nm。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用高效液相色譜工作站獲得空白及樣品中4-HAQO 峰的面積。根據(jù)以下公式計(jì)算菌株對致癌物4-NQO 的清除率：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株脫基因毒性能力測定

不同菌株脫基因毒性的測定結(jié)果如圖1 所示。

圖1 各種屬菌株清除率（圖中每一個點(diǎn)代表一株菌的清除率）Fig.1 The genotoxicity inhibition rate of lactic acid bacteria

試驗(yàn)菌株中有18.64%（11/59）具有較好的脫基因毒性的功能，其4-NQO 的清除率在75%以上。其余菌株（48 株）4-NQO 清除率均小于30%。試驗(yàn)中存在明顯脫基因毒性菌株的種屬有：唾液乳桿菌（9/9），發(fā)酵乳桿菌（2/9）。植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌四個種屬中均不存在清除率大于75%的菌株。清除率大于75%的菌株分別是唾液乳桿菌LS2（99.33%），LS3（99.47%），LS4（99.54%），LS5（99.64%），LS6（99.49%），LS7（99.73%），F(xiàn)DB81（95.78%），F(xiàn)DB86（78.35%），F(xiàn)DB88（75.14%），發(fā)酵乳桿菌M2-2（94.88%），M2-3（85.59%）。唾液乳桿菌種屬內(nèi)9 株菌全部具有較好的脫基因毒性作用。

2.2 嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)

嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)見圖2。

圖2 嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)Fig.2 Dosage genotoxicity inhibition effect of Lactobacillus salivarius isolated from infant

本試驗(yàn)中所篩選的唾液乳桿菌分為嬰兒腸道和長壽老人腸道兩種來源。本研究首先對嬰兒腸道來源唾液乳桿菌的量效關(guān)系進(jìn)行研究。如圖2 所示，各菌株在量效關(guān)系試驗(yàn)中所達(dá)到的最大清除率分別為LS2 79.37 %，LS3 48.80 %，LS4 84.34 %，LS5 28.01 %，LS6 37.00%，LS7 66.00%。嬰兒來源唾液乳桿菌組的最小有作用劑量為5×108cfu/mL。隨菌懸液濃度增大，唾液乳桿菌清除率都出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。LS2，LS3，LS5，LS7 等4 株菌在5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。而LS4 在2.5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。

2.3 長壽老人來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)

長壽老人來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)見圖3。

圖3 長壽老人腸道來源唾液乳桿菌的劑量效應(yīng)Fig.3 Dosage genotoxicity inhibition effect of Lactobacillus salivarius isolated from centenarians

各菌株在量效關(guān)系試驗(yàn)中所達(dá)到的最大清除率分別為FDB81 69.02%，F(xiàn)DB86 75.73%，F(xiàn)DB88 49.40%。三株菌的來源唾液乳桿菌組的最小有作用劑量為5×108cfu/mL。隨菌懸液濃度增大，唾液乳桿菌清除率都出現(xiàn)了先增大后減小的趨勢。FDB86，F(xiàn)DB81 等2 株菌在5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。而FDB88 在2.5×109cfu/mL 這一濃度清除率達(dá)到最大值。達(dá)到最大后，隨著菌液濃度的升高，清除率呈明顯下降趨勢。

2.4 發(fā)酵乳桿菌的劑量效應(yīng)

發(fā)酵乳桿菌的劑量效應(yīng)見圖4。

圖4 發(fā)酵乳桿菌的脫基因毒性的劑量效應(yīng)Fig.4 Dosage genotoxicity inhibition effect of Lactobacillus fermentium

從結(jié)果可以看出：發(fā)酵乳桿菌的劑量效應(yīng)曲線與唾液乳桿菌有很大不同，發(fā)酵乳桿菌組的最小有作用劑量為1×107cfu/mL。隨菌懸液濃度增大，發(fā)酵乳桿菌的基因毒性清除率呈上升趨勢。劑量為1×1010cfu/mL時，M2-2 的清除率達(dá)到80.83%，而M2-3 的清除率達(dá)到67.18%。唾液乳桿菌與發(fā)酵乳桿菌這兩個種屬的菌，在脫除基因毒性量效關(guān)系上表現(xiàn)出了不同的特點(diǎn)。這種不同可能是因?yàn)閮删N脫毒機(jī)理不同造成的。

3 結(jié)論

通過檢測菌體與致癌物4-NQO 共培養(yǎng)后致癌物質(zhì)的殘留量對菌體的脫基因毒性功能強(qiáng)弱進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明：在選取的6 個不同種屬共計(jì)55 株乳酸菌中，有11 株乳酸菌具有較強(qiáng)的基因毒性脫除作用，脫除率大于75%。其中唾液乳桿菌9 株，發(fā)酵乳桿菌2株。不同種類乳酸菌脫除基因毒性的劑量反應(yīng)關(guān)系和最小作用劑量不同。對于不同來源的唾液乳桿菌，劑量反應(yīng)關(guān)系基本呈先上升后下降的趨勢，最小作用劑量為5×108cfu/mL。而發(fā)酵乳桿菌隨菌懸液濃度增大，發(fā)酵乳桿菌的基因毒性清除率呈上升趨勢，而且菌體濃度在1×107cfu/mL 時既能表現(xiàn)出明顯的脫基因毒性功能。此結(jié)果也說明，不同種類的乳酸菌脫除基因毒性的過程和機(jī)理存在著一定的區(qū)別。

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