Toll樣受體和核轉錄因子-κB在子癇前期患者胎盤組織中的表達

王艷麗 張潔 裴素珍

Toll樣受體和核轉錄因子-κB在子癇前期患者胎盤組織中的表達

王艷麗①張潔①裴素珍①

目的：探討子癇前期患者胎盤組織中Toll樣受體4（TLR4）以及核轉錄因子（NF-κB）表達及意義。方法：選取50例子癇前期患者（輕度子癇前期20例，重度子癇前期30例）作為研究對象，以30例正常晚孕婦女作為正常對照，采用免疫組化及逆轉錄－聚合酶鏈反應（RT-PCR）法測定胎盤組織中TLR4及NF-κB的定位及表達。結果：輕、重度子癇前期患者胎盤組織中TLR4及NF-κB蛋白和mRNA的表達水平均明顯高于正常晚孕婦女（P<0.05）。且隨著病情加重，兩者表達均增強；子癇前期胎盤組織中TLR4和NF-κB的表達呈正相關（P<0.05）。結論：TLR4介導的炎癥因子釋放可能是導致子癇前期發生的重要原因之一。

子癇前期； 胎盤； TLR4； NF-κB

子癇前期（Preeclampsia，PE）是一種妊娠期特發性疾病，以孕期出現高血壓和蛋白尿為主要特征的多器官損害疾病，發病率為3%～14%，是目前產科領域的研究重點之一。本研究通過對子癇前期胎盤組織中Toll樣受體4（TLR4）以及核轉錄因子（NF-κB）表達水平的研究，初步探討TLR4和NF-κB在子癇前期胎盤組織中表達的意義，并為臨床診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月-2012年12月在本院產科住院剖宮產分娩的產婦胎盤標本共80例。50例子癇前期（輕度子癇前期20例、重度子癇前期30例）患者為病例組，平均（29.30±2.80）歲，孕周（37.74±1.18）周；30例正常妊娠婦女（因橫位、臀位、骨盆狹窄、高齡初產、社會因素等行剖宮產）為對照組，平均（28.10±2.50）歲，孕周（39.06±1.72）周。兩組均為單胎初產，均未進入產程。全部研究對象符合以下條件：無胎盤早剝、前置胎盤、母兒血型不合、妊娠期糖尿病等產程并發癥，既往體健，兩組孕婦月經規則，末次月經清楚。兩組孕婦的年齡、孕產次、孕周等比較差異無統計學意義（P>0.05）。子癇前期診斷標準參照樂杰主編《婦產科學》第7版為標準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與處理 胎盤娩出后立即取胎盤組織中央帶母體面至胎兒面2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm，避開梗死及鈣化區，經生理鹽水充分漂洗后，用10%中性福爾馬林溶液固定24 h以上，常規石蠟包埋4 μm連續切片。

1.2.2 免疫組織化學染色 采用免疫組化SP法檢查胎盤組織中TRL4和NF-κB p65的表達。主要試劑如第一抗體兔抗人TLR4多克隆抗體購自美USbiological公司，兔抗人NF-κB p65多克隆抗體為美國Neomarker/Labvision公司產品（購自天津津脈公司），TLR4抗體工作濃度1：100，NF-κB p65抗體工作濃度1：50。SP試劑盒及DAB染色試劑盒均由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。主要步驟按SP免疫組化試劑盒內說明書進行。用已知的TLR4和NF-κB p65陽性切片做陽性對照，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作空白對照。TLR4和NF-κB p65以鏡像在細胞胞漿和/或胞核內呈棕黃色顆粒即定為陽性表達。隨機分別選擇10個高倍視野（×100），記數100個細胞，將陽性細胞百分率分為4級，陽性細胞百分率<5%為陰性（-）、5%～25%為弱陽性（+）、25%～50%為中等強度陽性（++）、>50%為強陽性（+++）。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR） 引物合成由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。引物序列如下：TLR4基因上游引物為5’-GCCGGAAAGTTA-TTGTGGTGGT-3’，下游引物為 5’-ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3’。NF-κB p65 上游引物為 5’-AACACTGCCGAGCTCAAGAT-3’，下游引物為5’-CA-TCGGCTTGAGAAAAGGAG-3’。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物為5’-TGAACGGGGAAGCTCACTGG-3’，下游引物為5’-TCCACCACCCTGTTG-CTGGA-3’。Trizol試劑提取總RNA，按照Promega試劑盒說明，逆轉錄為cDNA，進行RT-PCR擴增反應。反應條件：預變性95 ℃ 10 min，變性 95 ℃ 15 s，退火 56 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 45 s，共 35個循環。取PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，mRNA表達相對值=目的片段的光密度值/GAPDH的光密度值。

1.3 統計學處理 實驗數據用SPSS 10.0統計學軟件進行處理。計量資料以（）表示，多組資料間比較采用 字2分析，兩兩比較采用LSD方法，計數資料多組資料用多個獨立樣本比較的Kruskal-Wallis H檢驗。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測TLR4和NF-κB p65的表達 TLR4在病例組和對照組胎盤組織中的定位部位無差異，陽性染色均呈棕黃色顆粒，主要定位于絨毛合體滋養細胞的胞漿中。鏡下觀察，子癇前期胎盤著色強度普遍要強于正常妊娠胎盤，TLR4表達呈強陽性，較對照組顯著增加，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。NF-κB在病例組和對照組胎盤組織中的定位部位無差異，陽性染色均呈棕黃色顆粒，主要分布于絨毛合體滋養細胞、絨毛毛細血管內皮細胞的胞漿和/或胞核中。鏡下觀察，子癇前期胎盤著色強度普遍要強于正常妊娠胎盤，絨毛滋養細胞增生處著色更強，NF-κB表達呈強陽性，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 子癇前期和正常孕婦胎盤組織TLR4和NF-κB表達情況比較 例

2.2 RT-PCR檢測TLR4和NF-κB p65 mRNA的表達水平 TLR4和NF-κB p65 mRNA在正常妊娠組的表達相對較低，在子癇前期組胎盤組織中的表達水平明顯升高，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。且子癇前期重度子癇前期組明顯高于輕度子癇前期組，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。見表 2。

2.3 子癇前期胎盤組織中TRL4和NF-κB表達的相關性 經等級相關分析表明，在輕度子癇前期和重度子癇前期患者胎

表2 子癇前期和正常孕婦胎盤組織TLR4和NF-κB mRNA相對值的比較（）

表2 子癇前期和正常孕婦胎盤組織TLR4和NF-κB mRNA相對值的比較（）

組別 TLR4 NF-κB正常妊娠組（n=30） 1.198±0.093 1.352±0.094子癇前期組（n=50） 1.678±0.203* 1.654±0.187*輕度子癇前期組（n=20） 1.451±0.069* 1.454±0.082*重度子癇前期組（n=30） 1.829±0.087*△ 1.788±0.095*△

*與正常妊娠組比較，P<0.05；△與輕度子癇前期組比較，P<0.05盤組織中TRL4和NF-κB表達呈正相關（γ=0.916、0.875，P<0.05）。

3 討論

目前，越來越多的證據顯示，慢性感染和炎癥被認為是子癇前期發病最重要的后天性和環境因素，Sersam[1]研究表明炎癥參與子癇前期的發生發展過程，子癇前期患者的血清和胎盤中的炎性因子水平都明顯升高。在子癇前期孕婦的外周血中發現了大量的病原微生物，如細菌、病毒、真菌、肺炎衣原體、巨細胞病毒、腺病毒等。天然免疫系統可通過各種模式識別病原微生物的糖脂類、核酸等分子，引起機體反應，而TLR4/NF-κB信號通路在其中可能起重要作用。Toll樣受體4（TLR4）是發現最早的Toll樣受體（TLR）家族的重要成員之一，在天然免疫中發揮著重要作用。核轉錄因子（NF-κB）是廣泛存在于哺乳動物細胞中的一種重要轉錄調控因子，能與多種基因啟動子中含有的κB序列結合，發揮轉錄因子作用，激活多種與細胞生長或凋亡相關的細胞因子轉錄。本研究從蛋白水平和RNA水平探討TLR4和NF-κB在子癇前期胎盤組織中表達及意義。

Toll樣受體是參與天然免疫的一類古老的蛋白質家族，TLRs在細胞信號轉導中發揮重要的作用。1997年Medzhitov等[2]發現了第一個存在于人細胞表面的Toll樣蛋白，稱Toll樣受體。目前在人體內已發現多達15種的Toll樣受體家族成員，Pineda等[3]研究表明TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-9在子癇前期患者胎盤組織中表達增強。TLR4是TLRs家族中最重要的成員之一。Kim等[4]的實驗表明在PE合并早產的胎盤中，TLR4表達量顯著高于單純早產，甚至高于早產合并絨毛膜羊膜炎者。Xie等[5]研究表明PE患者外周血中TLR4轉錄水平顯著增加，早發型者尤為明顯，TLR4在胎盤的抗感染免疫中發揮了重要作用。TLR4可識別微生物的細胞膜成分，其被激活后，主要通過髓樣分化因子88-依賴性通路激活下游炎癥信號，轉錄調控各種炎癥細胞因子、化學因子、抗菌產物及一些共刺激分子，產生多種生物學效應。本研究采用免疫組化和RT-PCR法檢測子癇前期患者胎盤組織中TLR4表達情況，結果提示子癇前期患者和正常妊娠孕婦胎盤組織中TLR4均有表達，子癇前期組表達陽性率和表達強度顯著高于正常孕婦組，并在正常孕婦組、輕度子癇前期和重度子癇前期中呈遞增趨勢。

NF-κB是一種細胞內普遍存在的核轉錄因子，在啟動和調控機體免疫應答、炎癥反應及細胞增值分化、凋亡等多種生理病理過程中發揮重要作用，是多種重要前炎性因子的轉錄激活因子，其激活可以導致許多下游因子的基因啟動，通過對表達過程中最重要的環節即轉錄水平的調節來發揮功能[6]。NF-κB最常見的存在形式是p50和p65組成的異源二聚體，NF-κB與妊娠的研究顯示，NF-κB幾乎參與了妊娠的所有過程，并發揮者重要作用[7]。蘇雪梅等[8]研究子癇前期患者胎盤組織中NF-κB和腫瘤細胞壞死因子（TNF）-α、NADPH氧化酶、缺氧誘導因子（HIF）-1α、血管內皮細胞粘附分子-1（VCAM-1）、血小板源性生長因子（PDGF）等的表達及其相關性，結果顯示NF-κB的陽性表達率和表達強度顯著升高。本研究結果亦表明NF-κB在子癇前期患者胎盤組織中表達與正常胎盤組織相比明顯升高，且隨疾病的進展，表達漸增高。

近年來一些研究發現，TLR4通過對病原相關分子模式（PAMPs）進行模式識別，經一系列信號傳導分子最終激活NF-κB等信號分子的表達，從而激活免疫及炎癥反應[9-11]。從相關性結果分析來看，PE患者胎盤組織中TRL4和NF-κB表達呈正相關。本實驗結果證實了TLR4、NF-κB與子癇前期的關系，子癇前期患者胎盤中TLR4及NF-κB表達增加可能是子癇前期發病機制中的關鍵環節之一，推測可能存在某些內源性因素刺激胎盤組織TLR4，進而激活NF-κB，引發TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放，但激活TLR4的這些內源性因素有待深入研究。

[1] Sersam L W. Inflammatory markers in pre-eclampsia and related conditions[J]. Int J Gynaecol Obstet， 2009， 105（1）： 69-70.

[2] Medzhitov R， Preston-Hurlburt P， Jr Janeway C A. A human homologue of the drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity[J]. Nature， 1997， 388（6640）： 394-397.

[3] Pineda A， Verdin-Terán S L， Camacho A， et al. Expression of tolllike receptor TLR-2， TLR-3， TLR-4 and TLR-9 is increased in placentas from patients with preeclampsia[J]. Arch Med Res， 2011， 42（5）： 382-391.

[4] Kim Y M， Romero R， Oh S Y， et al. Toll-like receptor 4： a potential link between “danger signas”， the innate immune system， and preeclampsia?[J] Am J Obstet Gynecol， 2005， 193（3pt 2）： 921-927.

[5] Xie F， Hu Y， Turvey S E， et al. Toll-like receptors 2 and 4 and the cryopyrin inflammasome in normal pregnancy and pre-eclampsia[J].BJOG， 2010， 117（1）： 99-108.

[6] Kusunoki T， Sugai M， Gonda H， et al. CpG inhibits IgE class switch recombination through suppression of NF kappa B activity， but not through Id2 or Bcl6[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2005， 328（2）：499-506.

[7] Torchinsky A， Toder V. To die or not to die： the function of the transcription factor NF-kappaB in embryos exposed to stress[J]. Am J Reprod Immunol， 2004， 51（2）： 138-143.

[8]蘇雪梅，付勇，張莉，等.子癇前期患者胎盤組織中核轉錄因子-κB和腫瘤壞死因子-α的表達及其臨床意義[J].中國全科醫學，2011，18（14）：1562-1564.

[9]陳芳榮，龔護民，茹美艷. NF–κB在子癇前期中的表達和意義[J].中國婦幼保健，2011，26（24）：3700-3702.

[10]李亮. NF–κB與VCAM-1在子癇前期患者胎盤中的表達及意義[J].中國醫藥導報，2010，7（7）：150-153.

[11]陳碧霞，何明會. HIF-1α與NF–κB在妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中的表達及意義[J]. 中國醫藥導報，2010，38（1）：74-75.

Objective:To investigate the expression and the significance of Toll-like receptor 4 and the nuclear factor kappa B（NF-κB） in placenta of patients with preeclampsia.Method:Using immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR） to investigate the expression of Toll-like receptor 4 and NF-κB in placenta of 20 cases of mild preeclampsia， 30 cases of severe preeclampsia and 30 normal pregnancy respectively.Result:There were increased expression of TLR4 and NF-κB in preeclampsia compared to those in normal pregnancy（P<0.05）.Furthermore， the expression of TLR4 and NF-κB had increasing trend with aggravation. The expression of TLR4 and NF-κB in placenta of preeclampsia was positively correlated（P<0.05）.Conclusion:The releasing of inflammatory factors mediated by TLR4 may be one of the most important reasons for preeclampsia.

Preeclampsia； Placenta； Toll-like receptor 4； Nuclear factor kappa B

The First People’s Hospital of Zhengzhou City，Zhengzhou 450004，China

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.10.013①鄭州市第一人民醫院 河南 鄭州 450004

王艷麗

2013-11-25） （本文編輯：黃新珍）