亞低溫對大鼠腦損傷后TNF-α、IL-1β及NF-κB表達的影響

王亞楠 張 勇 王 寧 劉鑫穎 (唐山市工人醫院檢驗科，唐山063000)

亞低溫對大鼠腦損傷后TNF-α、IL-1β及NF-κB表達的影響

王亞楠①張 勇②王 寧 劉鑫穎 (唐山市工人醫院檢驗科，唐山063000)

目的:觀察亞低溫治療對創傷性腦損傷大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)及核轉錄因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)表達的影響，探討亞低溫的腦保護作用及可能機制。方法:將45只SD大鼠隨機分為假手術組(Sham組)，腦損傷組(TBI組)，亞低溫治療組。采用Marmarou’s法建立創傷性腦損傷大鼠模型，損傷后立即開始誘導亞低溫，持續3 h，于傷后1 d、3 d、5 d分別處死各組大鼠留取腦組織。采用干濕重法測量腦組織含水量，免疫組織化學法及Western blot法檢測各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β及NF-κB的蛋白表達情況。結果:與Sham組相比，TBI組大鼠腦組織含水量升高(P＜0.05)，3 d達水腫高峰，TNF-α、IL-1β和 NF-κB的表達顯著增加(P＜0.05)，均為1 d達高峰，持續高表達至5 d;與TBI組相比，亞低溫治療組大鼠各時間點腦組織含水量降低(P＜0.05)，TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達明顯減少(P＜0.05)。結論:高表達的TNF-α、IL-1β和NF-κB參與了TBI的病理過程。亞低溫治療可通過下調NF-κB信號分子，減輕創傷性腦損傷后腦組織的炎性反應，緩解腦水腫，進而起到腦保護作用。

亞低溫;創傷性腦損傷;腦水腫;大鼠

創傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)是神經系統常見疾病，占全身各部位損傷的第二位，死亡率居第1位，有較高的致殘率和致死高，嚴重影響人類的健康[1]。隨著對腦損傷發病機制的深入研究，細胞因子在繼發性腦損傷中發揮的作用開始備受關注。其中 TNF-α、IL-1β 及 NF-κB 在 TBI誘導的炎癥反應中起核心作用[2]。近幾年來，顱腦外傷的亞低溫治療開始被國內外學者所重視。亞低溫可緩解腦組織繼發性損傷，促進神經功能的恢復，具有明顯的腦保護作用[3]。盡管亞低溫在TBI的實驗研究和臨床治療中都取得了一定的成效，但其具體作用機制尚有待進一步研究。然而，亞低溫治療對TBI后大鼠腦組織 TNF-α、IL-1β及NF-κB 表達影響的報道少見。本實驗擬利用Marmarou’s法建立大鼠TBI模型，通過免疫組化與免疫印跡方法檢測TNF-α、IL-1β 及 NF-κB 的蛋白表達情況，并進行細胞因子表達的相關性分析，驗證亞低溫通過抑制NF-κB活化，下調炎性因子TNF-α和IL-1β的表達，阻斷炎癥級聯反應，減輕或避免繼發性炎癥反應引起的腦水腫，最終達到腦保護作用。以期為亞低溫治療腦損傷的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑 兔抗大鼠 TNF-α、IL-1β及 NF-κB多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology公司;小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司;羊抗兔或羊抗小鼠IgG-AP二抗購自武漢博士德生物有限公司;BCIP/NBT試劑購自南京建成生物有限公司;SABC免疫組化試劑盒、BCA試劑盒、TRIzol裂解液及蛋白酶抑制劑等均購自武漢博士德生物有限公司;DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物有限公司。

1.2 動物與分組 SPF清潔級成年健康雄性SD大鼠45只，體質量(260±20)g，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。將SD大鼠隨機分為三組:①假手術組(僅給予頭皮切開縫合，但不致傷)，②腦損傷組，③亞低溫治療組。根據各組取材時間點不同，每組又分為1 d、3 d、5 d三個亞組，每個亞組5只大鼠。

1.3 模型制備與亞低溫處理 參照改良Marmarou’s法[4]制備臨床常見的大鼠中度彌漫性腦創傷動物模型。腦損傷后立即將大鼠置于溫控環境中誘導亞低溫，誘導時間約為30 min，使大鼠肛溫控制在31℃ ～33℃，并持續3 h。

1.4 腦組織水含量測定 各組大鼠在各時間相斷頭并快速取腦組織，采用干濕重法測定水含量。用濾紙吸干腦表面水分，電子分析天平稱得濕重，后置入100℃烘箱烘烤至恒重，再稱其干重。按公式計

算腦組織水含量:腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 免疫組織化學染色 腦組織標本經常規固定、脫水透明、石蠟包埋、連續冠狀切片，按SABC免疫組化試劑盒說明進行操作。60℃烤片60 min，脫蠟至水，3%H2O2滅活 15 min，抗原熱修復，5%BSA封閉20 min，甩干后分別滴加兔抗大鼠的TNF-α、IL-1β 及NF-κB 多克隆抗體(稀釋濃度均為1∶50)，4℃冰箱過夜。羊抗兔或羊抗小鼠的IgG室溫孵育30 min，SABC 室溫 20 min，DAB 顯色5 min，雙蒸水終止顯色，封片后置于光學顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot分析 取各組大鼠的皮層腦組織100 mg，蛋白裂解液裂解，12 000 r/min，4℃離心 15 min，收集上清液，-80℃保存備用。進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，

轉移至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h，兔抗大鼠的 TNF-α、IL-1β、NF-κB(稀釋濃度均為 1∶500)，小鼠抗大鼠β-actin(稀釋濃度為1∶500)，4℃孵育過夜。羊抗兔或羊抗小鼠的 IgG-AP，37℃孵育2 h，BCIP/NBT避光顯色5 min，雙蒸水終止顯色。以Image J軟件對蛋白表達條帶進行灰度掃描及定量分析。以目標蛋白與 β-actin蛋白平均吸光度值(OD值)的比值作為分析對象。

1.7 統計學處理 用Excel建庫，實驗中所得數據均用x-±s表示，用SPSS16.0軟件進行統計學分析。兩組間比較選用t檢驗，單因素多組間比較用單因素方差分析，TNF-α和IL-1β與NF-κB相關關系采用 Pearson相關分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織含水量 Sham組腦組織含水量各時間點無明顯差異，TBI組1 d即出現明顯腦水腫，3 d水腫達高峰，5 d水腫逐漸消退，與Sham組相比均有統計學意義(P＜0.05)。亞低溫治療組各時間點較TBI組腦組織含水量明顯減少(P＜0.05)。見表1。

2.2 腦皮質TNF-α的定位表達 TNF-α陽性細胞呈現棕褐色，主要分布在神經細胞及炎性細胞的細胞漿及細胞膜。Sham組偶見 TNF-α陽性細胞。TBI組大鼠1 d在損傷灶及其周圍皮質可見較多深棕褐色陽性細胞，3 d及5 d有所減少。與TBI組同時相相比，亞低溫治療組TNF-α陽性細胞明顯減少，見圖1。

表1 各組大鼠腦組織的含水量(%，±s，n=10)Tab.1 Water content of brain tissue in each group(%， ± s，n=10)

表1 各組大鼠腦組織的含水量(%，±s，n=10)Tab.1 Water content of brain tissue in each group(%， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 77.49 ±0.37 77.81 ±0.41 77.62 ±0.28 TBI group 82.39 ±0.391)83.96 ±0.281)82.64 ±0.271) Treatment group 79.03 ±0.262)80.15 ±0.332)79.98 ±0.322)

表2 腦組織中TNF-α蛋白表達的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.2 Quantitative analysis of TNF-α expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表2 腦組織中TNF-α蛋白表達的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.2 Quantitative analysis of TNF-α expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

028 TBI group 1.225 ±0.0461)1.014 ±0.0321)0.904 ±0.0411) Treatment group 0.841 ±0.0372)0.682 ±0.0352)0.585 ±0.0292) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.219 ±0.024 0.193 ±0.016 0.202 ±0.

表3 腦組織中IL-1β蛋白表達的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.3 Quantitative analysis of IL-1β expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表3 腦組織中IL-1β蛋白表達的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.3 Quantitative analysis of IL-1β expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

027 TBI group 1.472 ±0.0491)1.183 ±0.0371)1.003 ±0.0381) Treatment group 0.906 ±0.0422)0.741 ±0.0352)0.681 ±0.0262) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.236 ±0.023 0.274 ±0.018 0.292 ±0.

圖1 腦組織中TNF-α的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.1 Expression of TNF-α in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

圖2 腦組織中IL-1β的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.2 Expression of IL-1β in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

圖3 腦組織中NF-κB的表達(免疫組織化學染色，×400)Fig.3 Expression of NF-κB in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

表4 腦組織中NF-κB蛋白表達的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.4 Quantitative analysis of NF-κB expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表4 腦組織中NF-κB蛋白表達的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.4 Quantitative analysis of NF-κB expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05，compared with TBI group，2)P ＜0.05.

029 TBI group 0.968 ±0.0471)0.806 ±0.0381)0.764 ±0.0321) Treatment group 0.543 ±0.0362)0.415 ±0.0272)0.391 ±0.0212) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.285 ±0.025 0.279 ±0.033 0.309 ±0.

圖4 Western blot檢測腦組織中TNF-α蛋白的表達Fig.4 Expression of TNF-α in brain tissue by Western blot

圖5 Western blot檢測腦組織中IL-1β蛋白的表達Fig.5 Expression of IL-1β in brain tissue by Western blot

圖6 Western blot檢測腦組織中NF-κB蛋白的表達Fig.6 Expression of NF-κB in brain tissue by Western blot

2.3 腦皮質IL-1β的定位表達 IL-1β陽性細胞為細胞漿或細胞膜出現棕褐色顆粒，主要定位在神經膠質細胞和浸潤的炎癥細胞。Sham組少見IL-1β的表達。TBI組大鼠皮質區IL-1β陽性細胞較多，1 d達高峰，3 d及5 d有所減少。亞低溫治療組較TBI組同時間相相比IL-1β陽性細胞數減少。見圖2。

2.4 腦皮質NF-κB的定位表達 NF-κB陽性細胞呈現棕褐色，主要分布在細胞漿和細胞核。Sham組偶見NF-κB陽性細胞。TBI組大鼠1 d即在皮質區出現較多NF-κB陽性細胞，傷后1 d即達高峰，3 d及5 d有所減少。與TBI組同時相相比，亞低溫治療組大鼠的NF-κB陽性細胞明顯減少。見圖3。

2.5 腦皮質TNF-α的定量表達 Sham組大鼠皮質區僅有微量TNF-α表達，TNF-α蛋白表達量在各時間點無變化;TBI組TNF-α的表達較Sham組明顯增多(P＜0.05)，動態表達與免疫組化結果相吻合;亞低溫治療組TNF-α蛋白表達時程與TBI組相似，但表達減少，各時間點差異均具有統計學意義(P＜0.05)。見圖4，表2。

2.6 腦皮質IL-1β的定量表達 Sham組大鼠皮質區IL-1β蛋白呈弱表達，且表達量在各時間點無變化;與Sham組相比，TBI組TNF-α的表達明顯增多(P＜0.05)，動態表達與免疫組化結果相吻合;與TBI組同時相相比，亞低溫治療組TNF-α蛋白表達顯著減少(P ＜0.05)。見圖5，表3。

2.7 腦皮質NF-κB的定量表達 Sham組各時間相NF-κB有微量的基礎表達;與Sham組相比，TBI組NF-κB的蛋白表達明顯增多(P＜0.05)，動態表達與免疫組化結果相吻合;亞低溫治療組NF-κB的蛋白表達與 TBI組同時相相比明顯減少(P＜0.05)。見圖6，表4。

2.8 相關性分析 創傷性腦損傷后損傷皮質區NF-κB的蛋白表達與TNF-α的蛋白表達水平呈正相關(各組r值均大于0，假設檢驗P＜0.01);同時與IL-1β的蛋白表達水平也呈正相關(各組r值均大于0，假設檢驗 P ＜0.01)。

3 討論

本次實驗發現大鼠創傷后腦損傷后早期腦組織中 TNF-α、IL-1β和NF-κB升高，并維持高表達狀態至傷后5 d，提示可能這些細胞因子間的相互作用引起炎癥級聯反應導致繼發性腦損傷的發生與發展。NF-κB是炎癥反應中關鍵性核轉錄因子，在非激活狀態下，NF-κB與其抑制分子(I-κB)以無活性形式存在于胞漿中，不具備轉錄活性[5]，被激活后與I-κB發生解體，啟動效應細胞中多種炎性因子的基因轉錄。基于這些推知 TBI后 NF-κB被激活，NF-κB可誘導腦組織效應細胞釋放大量炎性細胞因子，其中以TNF-α和IL-1β為主。二者主要來源小膠質細胞，可使腦組織發生過度炎癥反應，導致繼發性腦損傷。

本實驗就 TBI后 NF-κB的表達與 TNF-α(或IL-1β)的表達進行了相關性分析，結果顯示NF-κB與 TNF-α(或 IL-1β)均呈正相關性，揭示 NF-κB 可能正向調控TNF-α和IL-1β蛋白的表達，從而引發炎癥反應。TBI發生早期NF-κB的激活促進TNF-α和IL-1β的釋放，同時，TNF-α和IL-1β的釋放同樣可以反過來激活 NF-κB，引發級聯放大效應。這些細胞因子及其彼此間的相互作用共同維持組織過度的炎癥反應，最終導致腦水腫、顱內壓升高、神經細胞死亡及神經功能損害等繼發性腦損傷。其中腦水腫是最主要的繼發性腦損傷，是多種因素參與的復雜過程[6]。腦水腫是創傷性腦損傷早期死亡的主要原因，因此TBI發生后早期及時有效地控制腦水腫，可提高患者存活率。炎癥反應、自由基以及血管通透性的改變是腦水腫發生的主要機制。另外2013年 Rossi等[7]利用TBI小鼠模型研究發現肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light-chain kinase，MLCK)增加腦組織的含水量，MLCK的抑制劑可緩解腦水腫，促進神經功能的恢復。本實驗通過干濕重法測量各組大鼠腦組織的含水量，發現TBI后1 d即有明顯腦水腫出現，3 d達水腫高峰，水腫一直持續到傷后5 d。水腫高峰比炎性因子高峰出現的滯后性可以用腦水腫發生的炎癥機制解釋。

TBI后急性期的治療已經日趨成熟，但是對于TBI后多種繼發性腦損傷的治療尚沒有好的方案。目前，減輕腦水腫正成為治療繼發性腦損傷的關鍵靶點。因為TBI后誘導的炎癥反應在腦水腫的發生發展中具有重要作用，所以通過抑制與炎性反應相關細胞因子的表達或釋放，對于腦水腫的治療有十分重要的意義。近年來，隨著亞低溫(28℃ ～35℃)對多種疾病治療的不斷推廣，多數國內研究已證實亞低溫對TBI具有明顯的腦保護作用[8-10]。國外臨床研究顯示亞低溫可降低TBI患者的顱內壓，改善腦神經功能的恢復，顯著降低死亡率，且不產生任何嚴重并發癥[11]。據報道治療性亞低溫的多效性與潛在機制與如下幾點有關:降低腦代謝率，為氧的供給和需求之間營造平衡;減少自由基的形成;減少興奮性神經遞質的產生;防止神經細胞的死亡等[12，13]。Western blot結果顯示:TBI后給予亞低溫治療可顯著下調TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達，同時降低腦組織含水量，促進腦損傷的恢復。

本研究發現 TNF-α、IL-1β 和 NF-κB 的高表達參與TBI的發生發展過程，成為腦水腫的形成機理之一。TBI后立即給予亞低溫治療可下調NF-κB活性，抑制炎性細胞因子TNF-α和IL-1β的合成和釋放，緩解炎癥級聯反應所導致的腦水腫的形成。本次實驗完善了亞低溫腦保護作用機制的研究，為亞低溫臨床應用提供理論及實驗依據。

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[收稿2013-10-15 修回2013-12-11]
(編輯 倪 鵬)

Effect of mild hypothermia on expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB after traumatic brain injury in rats

WANG Ya-Nan，ZHANG Yong，WANG Ning，LIU Xin-Ying.Department of Laboratory，Tangshan Workers’Hospital，Tangshan 063000，China

Objective:To investigate the expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB in the cortex after traumatic brain injury in rats，in order to further explore the protective effects and possible mechanisms of mild hypothermia treatment.MethodsThe forty-five SD rats were randomly divided into Sham group，TBI group，treatment group.Rats model of TBI were established via Marmarou′s method.The animals were sacrificed at 1 d，3 d and 5 d post-TBI.The brain tissue was taken out to measure the water content based on wetdry weight method.The expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB proteins were detected by Immunohistochemistry and Western blot analysis.ResultsCompared with the Sham group，the brain water content was increased(P ＜0.05)，reached peak at 3 d post-TBI，the expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB was significantly increased(P ＜0.05)，reached peak at 1 d，sustained higher expression to 5 d post-TBI.Mild hypothermia treatment remarkably reduced the brain water content(P ＜ 0.05)，down-regulated TNF-α，IL-1β and NF-κB expression in comparision to the TBI group(P ＜0.05).ConclusionThe higher expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB in the cortex may play an important role in the pathogenesis of TBI.Mild hypothermia can suppress NF-κB signaling pathway，reduce inflammatory reactions，relieve cerebral edema，finally promoting brain injury recovery.

Mild hypothermia;Traumatic brain injury;Brain edema;Rats

R322.8

A

1000-484X(2014)05-0618-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.010

①唐山市工人醫院核醫學科，唐山063000。

②通訊作者，E-mail:zy20131015@126.com。

王亞楠(1975年-)，女，主管檢驗師，主要從事腦損方面的研究。