對小干擾RNA長期作用HBV轉基因小鼠抑制乙肝病毒復制的評價①

張衛云 孫朝暉 任廣立 石玉玲 李 薇 張 蓉 唐榮芝(廣州軍區廣州總醫院檢驗科，廣州510010)

對小干擾RNA長期作用HBV轉基因小鼠抑制乙肝病毒復制的評價①

張衛云 孫朝暉 任廣立②石玉玲 李 薇 張 蓉 唐榮芝(廣州軍區廣州總醫院檢驗科，廣州510010)

目的:探討小干擾RNA長期作用HBV轉基因小鼠對抑制乙肝病毒復制的評價。方法:siRNA表達載體經尾靜脈注射轉染HBV轉基因小鼠，設立特異性 siRNA組(pSilencer5.1/C2、pSilencer4.1/C2、pSilencer3.1/C2)、PBS對照組和陰性質粒對照組(n=10)。在注射后第6天、21天、1個月、3個月、6個月和9個月的不同時間經其內眥靜脈采血，采用化學發光法定量檢測小鼠血清中HBsAg水平，實時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA水平。結果:siRNA長期作用機體可使轉基因小鼠血清HBsAg和HBV-DNA水平顯著降低，特異性siRNA組與PBS對照組相比，差異有顯著統計學意義(P＜0.05)。而陰性質粒對照組與PBS組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。結論:基于載體的特異性siRNA長期作用HBV轉基因小鼠可抑制HBV的復制和表達，該抑制作用是特異性的。

小干擾RNA;HBV轉基因小鼠;乙肝病毒

乙型肝炎病毒(HBV)感染已成為嚴重威脅全球健康的主要問題之一，目前全球慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者已超過4億，約有15% ～25%的感染者最終可能死于HBV相關疾病，每年有100萬人死于HBV感染所導致的肝硬化、重型肝炎及肝細胞癌等。中國是HBV感染的高發地區，HBV乙肝表面抗原攜帶者占全國人口的10% ～15%。目前，針對慢性乙肝肝炎的抗病毒治療主要采用重組干擾素和以拉米夫定和阿德福韋為代表的核苷類似物，但是迄今為止，其治療效果卻不能讓人滿意，并伴有嚴重的副作用，停藥后的反彈和耐藥株的出現仍然是亟待解決的難題。反義核酸、核酶的研究開啟了基因治療HBV感染的序幕，雖然目前這些基因治療技術仍不能徹底清除HBV病毒，但作為基因治療之一的RNAi已被證實是一非常有開發前景的抗HBV治療手段之一[1，2]。因此，本文用 siRNA 表達載體經微靜脈長期注射HBV轉基因小鼠，觀察小鼠HB-sAg濃度和乙肝病毒復制水平的變化，評價小干擾RNA(siRNA)對乙型肝炎病毒(HBV)感染的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 HBV全基因轉基因小鼠50只，購自解放軍第458醫院全軍傳染病中心。小鼠體重(20±2)g，8～10周齡，雌雄分籠，運至本實驗室后置于相對清潔環境飼養，穩定2周后再進行實驗。分為特異性 siRNA 組(pSilencer5.1/C2、pSilencer 4.1/C2、pSilencer3.1/C2)、陰性質粒對照組和 PBS對照組，每組10只小鼠。

1.2 載體和主要試劑 從既往研究構建的載體[3-5]中選擇 pSilencer5.1/C2、pSilencer 4.1/C2組、pSilencer 3.1/C2三種載體;小鼠血清HBsAg抗原定量檢測用化學發光微粒子免疫檢測法，儀器為雅培Abbott i2000 SR全自動化學發光儀及原裝試劑。HBV-DNA定量檢測采用羅氏(LightCycler 480)實時熒光定量擴增儀，試劑為上海科華有限公司生產的HBV-DNA定量試劑盒。使用羅氏(LightCycler 480) PCR分析儀方法實時熒光PCR技術進行定量檢測，采用中山大學達安基因試劑盒進行定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測。

1.3 方法 參照文獻[6，7]采用高壓水尾靜脈注射法將既往構建的siRNA表達載體按5 mg/kg給藥，按小鼠體重的8%注入，均以PBS(1.5～2.0 ml)稀釋，10 s左右注射完成。在注射后6 d、21 d、1個月、3個月、6個月、9個月通過小鼠內眥靜脈采血，使用上述方法檢測HBsAg(U/ml)濃度和HBV-DNA定量拷貝數，計算出 HBsAg的抑制率，抑制率= (NPBS對照組－N實驗組)/NPBS對照組×100%。

2 結果

2.1 不同載體長期作用HBV轉基因小鼠對HBsAg濃度的影響 siRNA載體轉染HBV轉基因小鼠后，在治療6 d、21 d、1 月、3 月、6 月、9 月采血檢測小鼠血清中的HBsAg濃度，結果發現在治療的第6天特異性siRNA組與PBS對照組相比HBsAg濃度顯著

降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，至第21天時基本穩定于一較低水平表達，直到觀測的第9個月HBsAg濃度無明顯改變;而陰性對照組對HBV轉基因小鼠HBsAg水平無任何抑制作用。同時研究發現特異性siRNA組抑制效應在pSilencer5.1/C2載體最為明顯，pSilencer5.1/C2、pSilencer4.1/C2、pSilencer 3.1/C2對HBsAg的抑制效率在9個月時分別為 (92.80 ±0.93)%、(90.02 ± 0.92)%、(85.62 ±0.88)%，見表1。

2.2 轉染了siRNA載體的HBV轉基因小鼠血清的HBV-DNA水平 對轉染了siRNA載體的HBV轉基因小鼠在治療后上述同樣時間采血檢測小鼠血清中的HBV-DNA水平，結果發現在治療的第6天特異性siRNA組與PBS對照組相比HBV-DNA濃度顯著降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，而陰性對照組對HBV轉基因小鼠HBV-DNA水平無任何抑制作用。其中在特異性siRNA組中，以pSilencer5.1/ C2載體對HBV-DNA的抑制最顯著，其次pSilencer4.1/C2 稍強于 pSilencer3.1/C2，見圖 1。

圖1 不同載體長期作用HBV轉基因小鼠血清中HBVDNA濃度Fig.1 Long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice HBV-DNA serum concentration

表1 不同載體長期作用HBV轉基因小鼠血清中HBsAg濃度(U/ml，n=10)Tab.1 Long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice of HBsAg serum concentration(U/ml，n=10)

3 討論

RNAi是保守的進化機制，有利于對抗外來基因的入侵如病毒和轉座子等，是基因水平的抗病毒免疫機制，同時還參與自身基因表達的調控[8，9]。小非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是一類內源性、約21-25 nt長的 miRNAs(microRNA)或siRNAs，具有穩定的特異性序列以調節基因表達。這些RNA分子雖然很小，卻在基因表達的調控中扮演了重要的角色。目前在真核細胞內，siRNA的來源主要有兩種:一種是化學合成的 siRNA，操作簡單，但作用時間短、成本昂貴;另一種是構建 siRNA表達質粒，它可以在細胞內轉錄成短的發夾狀 shRNA，可以產生與化學合成的siRNA同樣的沉默效應，并且作用持久。siRNA不僅是一種研究基因功能的有力工具，而且在抗病毒復制方面具有很高的藥物開發價值[10，11]。

本實驗表明在特異性siRNA長期作用下HBV轉基因小鼠HBsAg濃度和乙肝病毒復制均被有效抑制，且與對照組有顯著性差異(P＜0.05)，其中pSilencer5.1/C2對病毒的抑制效率最高，因為pSilencer5.1/C2載體是一種基于逆轉錄病毒和聚合酶Ⅲ的雙啟動子表達載體，它既可以經反轉錄病毒包裝細胞系統達到siRNA的傳輸，也可以由聚合酶Ⅲ啟動子介導高水平的siRNA傳輸。pSilencer4.1/C2較高于pSilencer3.1/C2，這與不同載體的驅動子類型密切相關，pSilencer4.1/C2基于 Pol II的表達載體，pSilencer3.1/C2載體是基于聚合酶Ⅲ，研究發現PolⅡ可能在真核細胞的轉錄調控中起非常重要的作用，能夠介導有效的 siRNA合成和較強的RNAi效應，尤其對在體水平的調控，它可能主要負責體內mRNA轉錄。PolⅡ啟動子所驅動的siRNA表達同樣可以與PolⅢ啟動子驅動的siRNA表達相當，且不會引起非靶向效應的產生[12]。因此從長期抑制效果來看 pSilencer5.1/C2較 pSilencer4.1/C2和pSilencer3.1/C2來說是較為理想的抑制載體。

總之，特異性siRNA可以有效的抑制HBV的復制和表達，但siRNA對已存在的HBVCCCDNA沒有作用[13]，徹底清除 HBV尚有一定的困難，因此，加強病毒性肝炎的預防及探求慢性肝炎的有效治療方法，仍是當前亟待解決的重大課題。

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[收稿2013-10-10 修回2013-11-18]

(編輯 倪 鵬)

Evaluation of long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice on inhibit replication of hepatitis B virus

ZHANG Wei-Yun，SUN Zhao-Hui，REN Guang-Li，SHI Yu-Ling，LI Wei，ZANG Rong，TANG Rong-Zhi.Department of Clinical Laboratory，General Hospital of Guangzhou Military Command of PLA，Guangzhou 510010，China

Objective:To investigation of the long-term-siRNA treatment with HBV transgene mice on inhibit replication of hepatitis B virus.MethodsThe constructed siRNA expressed vectors was transfected HBV transgene mice by hydrodynamics-based injection via vena caudalis.Different groups were set including:specificity siRNA groups(pSilencer5.1/C2，pSilencer4.1/C2，pSilencer3.1/C2)，PBS group and negative vector group(n=10).The effect was observed in different periods(6 d，21 d，1 months，3 months，6 months and 9 months after injection).HBsAg was analyzed by Chemiluminescence method，HBV-DNA was analyzed by real time quantitative PCR(RQ-PCR).ResultsCompared with the PBS group，specificity siRNA groups showed decreased levels of HBsAg and HBV-DNA(P ＜0.05).Negative vector group did not show such changes，there were no significant differences(P ＞0.05).ConclusionThe siRNA based on the expression vector can suppress the expression and replication of HBV in HBV transgene mice.The inhibition effects of long-term-siRNA treatment was specific.

siRNA;HBV transgene mice;Hepatitis B virus

R392.7

A

1000-484X(2014)05-0666-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.021

①本文為廣東省醫學科研基金(A2012444)。

②廣州軍區廣州總醫院兒科，廣州510010。

張衛云(1978年－)，女，主管技師，主要從事臨床免疫學方面研究，E-mail:1261349825@qq.com。