骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的調節作用

鄭貴星 李翊泉 魏小平 吳 頡 黃 俊 (廣州醫科大學附屬第一醫院輸血科，廣州510120)

骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的調節作用

鄭貴星 李翊泉 魏小平①吳 頡①黃 俊②(廣州醫科大學附屬第一醫院輸血科，廣州510120)

目的:探討骨髓間充質干細胞抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的免疫調節相關機制。方法:分離、培養并鑒定大鼠的骨髓間充質干細胞，采用MTT法觀察其對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力的影響，采用流式細胞儀分析骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠CD4+CD25+調節性T細胞比例、細胞周期和細胞凋亡的影響。結果:B組和C組的吸光度值明顯低于A組，數據之間比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，C組吸光度值明顯低于B組，數據之間比較差異有統計學意義(P＜0.05);B組和C組的CD4+CD25+調節性T細胞比例均明顯高于A組，數據比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，C組CD4+CD25+調節性T細胞比例明顯高于B組，數據比較差異有統計學意義(P＜0.05);B組和C組的細胞凋亡水平明顯高于A組，數據比較差異有統計學意義(P＜0.05)，C組細胞凋亡水平明顯高于B組，數據比較差異有統計學意義(P＜0.05)。結論:骨髓間充質干細胞可以顯著抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖，其機制可能通過調節CD4+CD25+調節性T細胞比例，促進細胞凋亡，繼而影響T淋巴細胞的免疫功能，發揮其抑制能力。

骨髓間充質干細胞;Ⅰ型糖尿病;大鼠;淋巴細胞

Ⅰ型糖尿病屬于特異性自身免疫病，該疾病的發生是通過一種尚不完全清楚的機制介導T淋巴細胞調節發生破壞胰島素β細胞的過程[1]。骨髓間充質干細胞可參與T淋巴細胞的調節，并通過多種免疫抑制介質參與炎性反應的控制過程[2]。此外，最新的研究表明骨髓間充質干細胞可降低糖尿病動物的血糖水平，但其具體機制尚不明確[3]。CD4+CD25+調節性T細胞是骨髓間充質干細胞的免疫調節的效應細胞也得到了證實。因此，其之間是否存在某種聯系，值得深思。為了探討骨髓間充質干細胞抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖的免疫調節相關機制以及可能途徑，我們采取一系列的技術研究，取得一定成果，現將相關內容報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器 本研究采用SD大鼠，共20只，年齡2～8周齡，購買于湖南中醫藥大學實驗動物中心，所需的各種培養基、鏈脲佐菌素、絲裂霉素以及胎牛血清等購買于美國Sigma公司，淋巴細胞分離液由上海義森生物科技有限公司提供。FACS Calibur流式細胞儀為BD公司生產，血糖儀購自三諾生物傳感技術股份有限公司。1.2 實驗方法

1.2.1 Ⅰ型糖尿病大鼠模型的建立 (1)選取10只體重為300g左右的SD大鼠，于標準SPF級別飼養環境飼養7 d后開始制作Ⅰ型糖尿病大鼠模型。(2)模型建立前，SD大鼠禁食6個小時，并采集鼠尾靜脈血一滴，測量SD大鼠血糖濃度，按照體重預先配制好鏈脲佐菌素溶液。(3)按每千克50 mg的標準，在SD大鼠腹腔注射10 g/L的鏈脲佐菌素，1次/d，連續注射5 d。(4)SD大鼠給予正常飲食，每周檢查一次SD大鼠的空腹靜脈血血糖水平。當大鼠出現I型糖尿病相關癥狀，包括多飲多食，體重下降等癥狀，并且血糖水平連續4周超過1.4 mmol/L時確定建模成功[4]。所有實驗動物均參照美國糖尿病并發癥動物模型協會相關標準進行飼養。

1.2.2 細胞培養方法 (1)選取約2周齡的健康SD大鼠，脫頸處死后于75%酒精浸泡消毒約10 min后。(2)于超凈工作臺取出股骨和脛骨，置于含有PBS的培養皿中，剪斷股骨和脛骨兩端，并使用含有10%FBS的DMEM培養液沖洗骨髓腔。(3)將所得液體離心收集細胞，用無菌吸管反復吹打，并去除雜質，制成細胞懸液。(4)將細胞懸液移入無菌離心管中，4℃，1 000 r/min離心 5 min，去除上清液，在離心管內加入含有胎牛血清的 DMEM培養液，混勻。(5)調整細胞濃度，接種于含抗生素的DMEM培養基中，置于37℃培養箱內進行培養。(6)每隔3 d換液一次。當細胞生長至約80%融合后，用相應濃度的胰蛋白酶消化傳代，取第三代骨髓間充質干細胞用于實驗。

選取上述Ⅰ型糖尿病大鼠，脫頸處死，75%酒精消毒10 min后，無菌條件下取出脾臟，置于含有5 ml的淋巴細胞分離液的培養皿中，研磨充分，轉移分離液于離心管內，加入1640培養基約400 μl，室溫下3 000 r/min離心30 min。并按照實驗淋巴細胞分離液操作說明書分離獲得淋巴細胞，DMEM培養基洗滌后，調整細胞濃度約為 1×108個/ml，備用。

1.2.3 組別設置 取生長良好的第三代骨髓間充質干細胞，使用絲裂霉素C(終止細胞分裂能力)處理1 h后，棄上清，并使用DMEM培養基洗滌3次，胰蛋白酶消化細胞，分別制成1×106和1×107兩組不同濃度的細胞懸液，然后按每孔100 μl的體積加入到24孔板中，并根據分組加入不同數量的淋巴細胞，以培養液補足體系。本研究根據骨髓間充質干細胞和淋巴細胞的比例分為3組，分別為A組(空白對照組，不加骨髓間充質細胞)、B組(淋巴細胞∶骨髓間充質干細胞=1∶0.1)和C組(淋巴細胞∶骨髓間充質干細胞=1∶1)。每組各設5個復孔，培養3 d后進行實驗，共進行5次實驗。

1.2.4 檢測方法 培養結束前6 h，向培養孔內加入20 μl的5 g/L的MTT，培養結束后，吸取懸浮的細胞，離心，分離并重懸細胞，每孔加100 μl二甲基亞砜，震蕩溶解結晶，酶標儀檢測波長490 nm的吸光度值。以吸光度A值為縱坐標，各組為橫坐標，繪制淋巴細胞增殖能力柱形圖。

收集上清液至流式管中，每組使用3個流式管，離心，并用PBS重懸細胞，調整細胞濃度為107個/ ml，其中一個管加入PE anti-rat CD4和FITC anti-rat CD25，余下兩管中一管加同型對照劑，另一管作空白對照，震蕩后，4℃孵育30 min，加入PBS混勻，洗滌2次，4℃條件下，1 000 r/min離心5 min，去上清，收集底層細胞，加入500 μl PBS，懸浮細胞，進行流式細胞儀檢測，結果采用CellQuest軟件分析。

收集每組孔內上清液于流式管中，4℃條件下，1 000 r/min離心5 min，去上清，并用 PBS重懸細胞，AnnexinV/PI雙染，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡和周期情況，雙陽性細胞為凋亡細胞。用CellQuest軟件對檢測結果進行數據分析。

1.3 統計學方法 利用 CellQuest軟件對流式細胞儀檢測結果進行數據分析，采用SPSS 17.0統計軟件對三組數據結果進行統計學分析，計數資料以絕對數和百分率表示，計量資料采用±s來表示，組間比較采用方差分析加q檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的骨髓間充質干細胞形態觀察 本研究，大鼠的骨髓間充質干細胞原代培養到5 d左右可見部分細胞呈長梭形或者三角形，呈散在分布，第三代細胞成長多呈梭形，比例約為90%生長均勻。如圖1所示。

2.2 光鏡下三組T淋巴細胞增殖情況觀察 在光

鏡下，可見B組的T淋巴細胞的增殖情況明顯低A組僅為T淋巴細胞增殖，而C組的T淋巴細胞的增殖情況明顯低于A組和B組的T淋巴細胞的增殖，表明骨髓間充質干細胞的存在抑制了T淋巴細胞的增殖，且隨著骨髓間充質干細胞的濃度增高，抑制程度增加，如圖2所示。

2.3 骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力影響 采用MTT法考察骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力影響，其中A組的吸光度值為0.64±0.055，B組的吸光度值為 0.52 ±0.044，C 組的吸光度值為 0.38 ± 0.052。B組和C組的吸光度值明顯低于A組，數據之間比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，C組吸光度值明顯低于B組，數據之間比較差異有統計學意義(P＜0.05)，詳細情況見表1，圖3。

圖1 骨髓間充質干細胞體外培養形態Fig.1 Bone marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro morphologicalNote:A.Primary culture of bone marrow mesenchymal stem cells in 5 days;B.The third generation culture of bone marrow mesenchymal stem cells in 3 days.

圖2 三組T淋巴細胞體系在光鏡下的增殖情況觀察Fig.2 Proliferation of T lymphocyte system in the light microscope between three groups

表1 三組細胞吸光度值比較Tab.1 Comparison of cell absorbance value between three groups

2.4 骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠CD4+CD25+調節性T細胞表達比例的影響 分析三組共培養體系的CD4+CD25+調節性T細胞表達比例發現，A組CD4+CD25+調節性T細胞比例為6.21± 0.72，B組 CD4+CD25+調節性 T細胞比例為14.32±0.89，C 組 CD4+CD25+調節性 T 細胞比例為23.67±1.26。B 組和C 組的CD4+CD25+調節性T細胞比例均明顯高于A組，數據比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，C組CD4+CD25+調節性T細胞比例明顯高于B組，數據比較差異有統計學意義(P＜0.05)。詳細情況見表2。

2.5 骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠細胞周期和細胞凋亡的影響 經檢測，三組共培養體系中，發現A組G0/G1期細胞比例為(97.33±1.22)%，細胞凋亡比例為(44.01±1.01)%;B組G0/G1期細胞比例為(97.45±1.32)%，細胞凋亡比例為(48.92±1.12)%;C組 G0/G1期細胞比例為(97.56 ±1.02)%，細胞凋亡比例為(58.87 ± 1.65)%。B組和C組的細胞凋亡水平明顯高于A組，數據比較差異均有統計學意義(P＜0.05)，C組細胞凋亡水平明顯高于B組，數據比較差異有統計學意義(P＜0.05)。三組共培養體系的細胞周期比較差異無統計學意義(P＞0.05)。詳細情況見表3。

圖3 骨髓間充質干細胞對Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖能力的影響Fig.3 Influence of lymphocyte proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells on typeⅠdiabetic rats

表2 三組共培養體系的CD4+CD25+調節性T細胞表達比例情況Tab.2 Expression ratio of CD4+CD25+regulatory T cells in three groups of co-culture system

表3 三組共培養體系的細胞周期和細胞凋亡情況Tab.3 Cell cycle and apoptosis in three groups of co-culture system

3 討論

骨髓間充質干細胞，具有多種功能，對骨髓中的造血干細胞具有機械支持作用，同時還能夠多向分化，參與多種組織損傷的修復[5]。此外，還可以通過特定的機制參與免疫調節。最新的研究還表明骨髓間充質干細胞的移植可以逆轉Ⅰ型糖尿病動物的血糖水平，但其機制尚不明確[3]。本研究發現，骨髓間充質干細胞能夠明顯抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞的增殖。

CD4+CD25+調節性T細胞，參與機體的免疫調節以及機體免疫損傷的控制[6]。相關文獻報道，CD4+CD25+調節性T細胞的缺失或者功能異常可導致機體免疫平衡的喪失，甚至自身免疫疾病的發生，如Ⅰ型糖尿病的發生和發展均可能與機體內CD4+CD25+調節性 T細胞功能紊亂相關[7]，而CD4+CD25+調節性T細胞的移植可阻止動物模型Ⅰ型糖尿病的病情的進一步發展[8]。最新的研究也表明，CD4+CD25+調節性T細胞是骨髓間充質干細胞參與免疫調節的重要效應細胞[9]。因此，CD4+CD25+調節性T細胞與骨髓間充質干細胞在調節Ⅰ型糖尿病病情發展中可能存在某種聯系。本研究發現在骨髓間充質干細胞與Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞的共培養體系中，淋巴細胞增殖能力受到明顯抑制，而CD4+CD25+調節性T細胞比例增高，且隨著骨髓間充質干細胞的增多，CD4+CD25+調節性T細胞比例升高。此外，共培養體系中的淋巴細胞凋亡水平升高，且隨著骨髓間充質干細胞比例增高凋亡水平也增高。表明骨髓間充質干細胞可能通過提高CD4+CD25+調節性T細胞比例促進細胞凋亡而抑制淋巴細胞的增殖。相關學者也證實，骨髓間充質干細胞可使T淋巴細胞周期停滯在G0/G1期，進而抑制其增殖，相關研究證實，下調活化的T淋巴細胞CD25和 CD69的表達，能夠抑制 IL-2和IFN-γ 的分泌[10]。

目前，骨髓間充質干細胞與淋巴細胞間的相互作用機制尚未完全清楚。而相關研究表明，骨髓間充質干細胞還可以分泌多種細胞因子，如IL-6、IL-11、LIF、M-CSF及SCF等，并且他們也參與了骨髓間充質干細胞的免疫調節過程[11]，而這些細胞因子在免疫調節過程中具體扮演什么樣的角色尚不清楚，還有待進一步研究。

綜上所述，骨髓間充質干細胞可以顯著抑制Ⅰ型糖尿病大鼠淋巴細胞增殖，其機制可能通過調節CD4+CD25+調節性T細胞比例，促進細胞凋亡，繼而影響T淋巴細胞的免疫功能，發揮其抑制能力。

[1]黃 盛，鄭 偉，范志勇，等.不同微環境對骨髓間充質干細胞分化為產胰島素細胞的影響[J].中華實驗外科雜志，2008，25 (3):368-370.

[2]江小霞，張 毅，李秀森，等.間充質干細胞對T淋巴細胞轉化的影響[J].解放軍醫學雜志，2005，30(2):130-132.

[3]東 波，張福琴，宋振順，等.骨髓間質干細胞及其來源的產胰島素細胞移植對受體胰島和新生血管的影響[J].中華實驗外科雜志，2009，26(7):865-867.

[4]李煜環，宋振順，范子揚.骨髓間充質干細胞體外對1型糖尿病大鼠淋巴細胞的免疫調節作用[J].中華實驗外科雜志，2011，28(2):209-211.

[5]Liotta F，Angeli R，Cosmi L，et al.Toll-like receptors 3 and 4 are expressed by human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and can inhibit their T-cell modulatory activity by impairing Notch signaling[J].Stem Cells，2008，26(1):279-289.

[6]Glennie S，Soeiro I，Dyson PJ，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells[J].Blood，2005，105(7):2821-2827.

[7]Tiritt M，Sgouroudis E D，Hennezel E，et al.Functional waning of naturally occurring CIM+regulatory T-cells contributes to the onset of autoimmune diabetes[J].Diabetes，2008，57(1):113-123.

[8]Elmani Z，Naji A，Zidi I，et al.Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25+highFOXP3+regulatory T cells[J].Stem Cells，2008，26(1): 212-222.

[9]Fontenot，Gavin，Rudensky.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J].Nat Immunol，2003，4(4):330-336.

[10]Nicola MD，Carlo-Stella C，Magni M，et al.Human bone marrowstromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J].Blood，2002，99(10): 3838-3843.

[11]張清軍，高 毅，潘明新，等.輸注受者骨髓間充質干細胞對肝移植大鼠免疫功能的影響[J].中華實驗外科雜志，2007，24(12):1499-1501.

[收稿2013-11-20 修回2013-12-12]
(編輯 張曉舟)

Regulation of bone marrow mesenchymal stem cells on lymphocyte proliferation of typeⅠdiabetic rats

ZHENG Gui-Xing，LI Yi-Quan，WEI Xiao-Ping，WU Jie，HUANG Jun.Department of Blood Transfusion，First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China

Objective:To investigate the regulation mechanisms of the bone marrow mesenchymal stem cells on lymphocyte proliferation of type I diabetic rats.MethodsThe rat bone marrow mesenchymal stem cells were isolated，cultured and identified and the effect on lymphocyte proliferation of typeⅠ diabetic rat was observed by MTT assay，and analyze the CD4+CD25+regulatory T cell ratio，cell cycle and apoptosis of type I diabetes rat by flow cytometric.ResultsB and C groups was significantly lower than the absorbance values of group A，the differences between the data were statistically significant(P ＜0.05)，C group was significantly lower than group B absorbance values，the difference was significant(P ＜0.05);the CD4+CD25+regulatory T cells of B and C groups were significantly higher than group A，the differences of the data were statistically significant(P ＜0.05)，the CD4+CD25+regulatory T cell ratio of C group significantly higher than that group B，the differences were statistically significant(P ＜0.05);the apoptosis levels of B and C groups were significantly higher than group A，the differences were statistically significant(P ＜0.05)，the apoptosis levels of C group were significantly higher in group B，the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionBone marrow mesenchymal stem cells can significantly inhibit lymphocyte proliferation of typeⅠ diabetic rats，and it may regulate CD4+CD25+regulatory T cells，promote apoptosis，thereby affecting the immune function of T lymphocytes，and play its rejection.

Bone marrow mesenchymal stem cells;Type Ⅰ diabetic;Rat;Lymphocytes

R392

A

1000-484X(2014)05-0677-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.024

①廣州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，廣州510120。

②廣州醫科大學病原生物學與免疫學教研室，廣州510180。

鄭貴星(1984年－)，男，技師，主要從事免疫學方面的研究。

及指導教師:黃 俊(1976年－)，男，博士，副教授，主要從事病原生物學與免疫學方面的研究。