金匱腎氣丸化裁方對良性前列腺增生大鼠前列腺組織VEGF、IGF-1表達的影響※

張喜奎 盧志銓 吳 棟

實驗研究

金匱腎氣丸化裁方對良性前列腺增生大鼠前列腺組織VEGF、IGF-1表達的影響※

張喜奎1盧志銓2吳 棟2

（1福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福州350004；2福建中醫藥大學，福州350108）

目的研究金匱腎氣丸化裁方對大鼠前列腺增生模型前列腺組織VEGF和IGF-1表達的影響。方法去勢加丙酸睪酮注射法建立大鼠前列腺增生模型，免疫組化學法檢測前列腺組織中血管內皮生長因子（VEGF）的表達，RT-PCR法檢測類胰島素生長因子-1（IGF-1）mRNA的水平。結果金匱腎氣丸化裁方中劑量組明顯降低前列腺增生組織中VEGF和IGF-1 mRNA的水平。結論金匱腎氣丸化裁抑制大鼠前列腺增生可能與調控生長因子表達水平有關。

金匱腎氣丸；良性前列腺增生；VEGF；IGF-1

良性前列腺增生癥（Benign prostatic hyperlasia，BPH）是老年男性的常見病、多發病之一。目前，現代醫學對BPH的治療主要采用藥物和手術等方法治療，但藥物治療效果并非很理想，手術、激光、尿道內支架等方法也都存在一定的并發癥［1］。有學者運用腎氣丸［2-4］加減治療BPH，取得了一定的療效，筆者在臨床中選用金匱腎氣丸化裁方治療BPH亦取得了滿意的療效。本實驗選用金匱腎氣丸化裁方對大鼠BPH模型進行干預，分別采用免疫組織化學法及RT-PCR法檢測前列腺組織中VEGF、IGF-1的表達水平，進而探討金匱腎氣丸化裁方治療BPH的作用機理。

1 材料與方法

1.1實驗動物Wistar大鼠，雄性，體重180～220g，共60只，從上海斯萊克實驗動物有限公司購進［許可證號：SCXK（滬）2012-0002］，在福建中醫藥大學動物實驗中心［許可證號：SYXK（閩）2009-0001］進行飼養。

1.2主要藥物與試劑①非那雄胺片：由杭州默沙東制藥有限公司生產，5mg／片（產品批號：322787）；②金匱腎氣丸化裁方：干地黃24g，山萸肉12g，山藥12g，澤瀉9g，牡丹皮9g，茯苓6g，附子3g，桂枝3g，益母草10g，川牛膝10g，荔枝核12g。劑量參考新世紀《方劑學》、《中藥學》本科教材及臨床用藥經驗，中藥飲片由福建中醫學院國醫堂提供。全方水煎提取濃縮至2g／mL，4℃保存備用；③丙酸睪酮注射液：由上海通用藥業股份有限公司生產，25mg／ml（產品批號：120102）；④VEGF免疫組化檢測試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司提供；⑤二步法免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司提供。⑥RT-PCR試劑盒：CWBIO公司提供。⑦溶媒：橄欖油，市售。

1.3主要儀器①離心機KDC-2046；②洗板機ELX-50；③石蠟切片機LEICA 2135；④光學顯微鏡OLYMPUS BX40；⑤醫學圖像分析系統CMIAS-2001B；⑥組織勻漿器Bio Masher。⑦ABI 7500型熒光定量PCR儀。

1.4模型建立與分組取60只Wistar大鼠，雄性，體重180～220g，普通飼養觀察1周，隨機取10只為空白對照組（Ⅰ組），另外50只進行造模。造模方法按文獻［5］并稍加改進。先用10%水合氯醛0.3m1／100g腹腔注射麻醉，常規消毒皮膚，經陰囊摘除雙側睪丸，術后肌內注射青霉素20萬U／只。去勢第7天隨機分為病理模型組（Ⅱ組）、非那雄胺片（Ⅲ組）及中藥低劑量組（Ⅳ組）、中藥中劑量組（Ⅴ組）、中藥高劑量組（Ⅵ組），每組10只。每日皮下注射丙酸睪丸酮5mg／（kg·d），誘導前列腺增生，空白對照組每日皮下注射等量生理鹽水，連續28d。

1.5給藥干預手術大鼠恢復7d后，開始為期28d的治療。Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組分別給予中藥低劑量、中藥中劑量、中藥高劑量灌胃，大鼠給藥量按照人與大鼠體表面積法換算，低、中、高3個劑量組擬為臨床等效量的0.5、1、2倍量。根據實際情況，原濃度2g／mL給藥相當于實際給藥量10g／kg。用蒸餾水作等比稀釋后按照5m1／kg灌胃給藥，每日1次。Ⅲ組給予非那雄胺片1mg／（kg·d）灌胃，Ⅰ組、Ⅱ組分別予等量生理鹽水灌胃。每7d稱重1次，根據體重調節給藥劑量。

1.6標本采集給藥4周后，用頸椎脫臼法處死大鼠，取出前列腺組織，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，用于VEGF檢測，一部分迅速放入-80℃冰箱冷藏，用于IGF-1檢測。

1.7觀測指標及檢測方法①一般情況：每日觀察大鼠的精神狀態、活動、被毛、二便、飲食等情況；治療前后每周稱體重一次；②免疫組織化學法檢測前列腺組織中VEGF的表達：按ABC法常規步驟操作，陰性對照用PBS代替一抗。棕黃色染色為VEGF陽性表達。選取細胞分布均勻的高倍視野作為觀察區，將鏡下陽性細胞數同總細胞數相比較，得到陽性細胞的表達率。每張切片觀察5個視野，取其平均值。③RT-PCR方法檢測前列腺組織中IGF-1 mRNA的表達：超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0581）提取RNA，DNaseⅠ試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW2090）對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理。HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0744）進行逆轉錄合成cDNA。選取各樣本cDNA分別用UltraSYBR Mixture（With ROX）（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0956）進行實時擴增，采用熒光定量PCR儀實時定量，并形成擴增產物溶解曲線圖，三孔重復CT值，取平均CT值，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

1.8統計學分析方法與評價實驗數據均采用平均值士標準差（x±s）表示，應用SPSS18.0統計軟件包進行統統計分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05差異具有統計學意義，P＜0.01為具有顯著性差異。

2 結果

2.1一般情況觀察空白對照組大鼠反應敏捷，神志、飲食、二便正常，皮毛致密而白凈。病理模型組大鼠飲食減少，消瘦，皮毛蓬松，脊背毛色呈黃褐色，枯槁無光澤。中藥低劑量組大鼠情況與病理模型組比較差別不大，其余各治療組大鼠一般情況好于病理模型組。

2.2各組大鼠前列腺組織中VEGF的表達比較病理模型組與空白對照組相比，VEGF呈現出強陽性的表達反應，即模型大鼠前列腺增生發生、發展過程中，在前列腺組織中存在VEGF的過度表達；非那雄胺組、金匱腎氣丸化裁方低、高劑量組與病理模型組比較雖有所減輕但遠未達到正常，說明非那雄胺組、金匱腎氣丸化裁方低、高劑量組能抑制VEGF表達，但效果不佳；而金匱腎氣丸化裁方中劑量組能明顯抑制VEGF的表達，且趨近于空白對照組的表現，見表1。

表1 各組大鼠前列腺組織中VEGF的表達比較 （x±s，n=10）

2.3各組大鼠前列腺組織中IGF-1 mRNA的表達比較與空白組相比，病理模型組IGF-1 mRNA表達升高最為顯著；與模型組相比，中藥低劑量組IGF-1 mRNA表達降低無差異（P＞0.05），非那雄胺組、高劑量組IGF-1 mRNA表達降低有差異（P＜0.05），中劑量組存在顯著差異（P＜0.01）；與非那雄胺組相比，中藥中劑量組IGF-1 mRNA表達降低存在顯著差異（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠前列腺組織中IGF-1 mRNA的表達比較 （x±s）

3 討論

現代生理學研究表明，前列腺組織中含有各種生長因子，這些生長因子與前列腺細胞的增殖與凋亡均有直接關系。正常情況下，生長促進因子與生長抑制因子的作用保持相對平衡，前列腺才能正常地發育、生長，并維持其結構與功能的完整［6］。VEGF是血管內皮細胞增殖過程中一個主要的正性調節因子［7］，有研究表明VEGF主要促進血管內皮增生并增加血管通透性，在BPH中呈高表達［8］。IGF-1是一種前列腺上皮細胞的有絲分裂原，對正常和轉化的前列腺上皮細胞具有抗細胞凋亡和促有絲分裂的作用。有學者發現，IGF-1水平的高低與前列腺增生的程度呈正相關［9］。

良性前列腺增生多屬中醫“癃閉”“精癃”病癥的范疇。中醫認為，BPH基本病機是腎氣虧虛，瘀血痰濁聚結，病性多為本虛標實、虛實夾雜。治療上應標本兼顧，既重視腎氣虧虛之本，又兼顧瘀血阻滯之標，充其腎氣，化其瘀滯。金匱腎氣丸化裁方由《金匱要略》腎氣丸方加味而成，全方由干地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、附子、桂枝、益母草、川牛膝、荔枝核組成。諸藥相合，共奏補益腎氣，活血化瘀，緩消癓瘕之效。全方非常切合BPH的基本病機。

本實驗免疫組化結果顯示，模型組大鼠前列腺組織VEGF陽性表達率明顯高于對照組，中藥劑量組VEGF陽性表達率則明顯低于模型組，而趨近于對照組，說明金匱腎氣丸化裁方可以抑制VEGF的表達。RT-PCR熒光定量顯示，IGF-1在模型組大鼠前列腺組織中表達水平明顯高于對照組和中藥中劑量組，而對照組與中藥中劑量組之間無統計學差異，說明金匱腎氣丸化裁方可以有效抑制BPH大鼠前列腺組織中IGF-1的表達。因此，通過調控生長因子表達水平，可能是金匱腎氣丸化裁方抑制前列腺增生的作用機理。

［1］Harkaway RC，Issa MM.Medical and minimally invasive therapies for the treatment of benign prostatic hyperplasia［J］.Prostate Cancer Prostatic Dis，2006，9（3）：204-214.

［2］劉文兵.金匱腎氣丸治療前列腺增生癥46例臨床觀察［J］.長春中醫藥大學學報，2009，25（2）：243.

［3］壽仁國.金匱腎氣丸加味治療前列腺增生122例［J］.江西中醫藥，2007，8（296）：31.

［4］劉艷.金匱腎氣丸治療前列腺增生癥20例臨床觀察［J］.長春中醫藥大學學報，2009，25（4）：540.

［5］中華人民共和國衛生部藥政局，新藥（西藥）臨床前研究指導原則匯編［M］.北京：人民衛生出版社，1993：101-103.

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［8］邵繼春，王毅，張蜀武，等.睪酮刺激大鼠前列腺增生模型的血管新生及調控因子研究［J］.中華男科學雜志，2005，11（6）：413-418.

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Effects of Modified Jinkui Shenqi pill on the Expression of Benign Prostatic Hyperplasia Rats prostate's VEGF，IGF-1

Zhang Xikui1Lu Zhiquan2W u Dong2
（The Second A ffiliated Hospital，Fujian uniuersity of traditional Chinesemedicine，Fuzhou，350004，China）

ObjectiveTo study the therapeutic efficacy of Modified Jinkui Shenqi piu on the expression of VEGF，IGF-1 in prostate of benign prostate hyperplasia（BPH）rat model.MethodsRats were removal both of didymus and injected testosterone propionate to make model of benign prostatic hyperplasia rat.Use the method of immunohistochemistry to detect the expression of vascular endothelial growth factor VEGF，detect the level of insulin-like growth factor-one（IGF-1）mRNA in hyperplasia prostate tissue by RT-PCR.ResultsModified Jinkui Shenqi pill middle dose group could significantly reduce the levels of VEGF and IGF-1 mRNA in hyperplasia prostate tissue.ConclusionModified Jinkui Shenqi pill restrain benign prostatic hyperplasia may be related with regulate the expression of growth factors.

Jinkui Shenqi pill；Benign prostatic hyperplasia；VEGF；IGF-1

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.04.090

：1672-2779（2014）-04-0142-03

蘇 玲 本文校對：盧志銓

2013-11-08）

福建省自然科學基金計劃項目［3201-803110024］