均勻設計優選干蟾中吲哚類生物堿的水提工藝※

李 偉 王元清 嚴建業 羅 堃*

均勻設計優選干蟾中吲哚類生物堿的水提工藝※

李 偉1王元清2，3嚴建業2羅 堃2*

（1湖南省湘潭市中心醫院，湘潭411100；2湖南中醫藥大學藥學院中藥現代化教育廳重點實驗室，長沙410208；3中南林業科技大學生命科學與技術學院生物技術與工程實驗室，長沙410004）

目的優選干蟾中吲哚類生物堿的最佳提取工藝。方法以吲哚類生物堿浸出量、浸膏得率為評價指標，對提取次數進行考察；選擇浸泡時間、提取時間、溶媒用量等為影響因素，應用均勻設計優選其最佳提取工藝。結果最佳工藝條件為：水提3次，浸泡15min，加水量為14倍、12倍、12倍，提取時間為100min、80min、80min。結論該工藝穩定，可行，能為其工業化生產提供實驗依據。

干蟾；均勻設計；提取工藝；吲哚類生物堿

干蟾收載于衛生部部頒標準，為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B.melanostictus Schneider的去除內臟的干燥全體［1-2］，其提取物具有強心、抗腫瘤、抗病毒、止痛、促進骨髓增生等功效［3-4］。干蟾中有效活性成分主要分為水溶性成分和脂溶性成分，前者主要為吲哚類生物堿，后者主要有酯蟾毒配基等［5］。其中吲哚類生物堿具有較強的抗腫瘤、免疫調節、抗乙肝病毒等多種藥理作用。干蟾中吲哚類生物堿的含量較低，有關其提取工藝研究尚未見報道，本文首次采用均勻設計法結合多指標綜合評價來優選其水提工藝，為其進一步的制劑開發和工業化生產奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1儀器SP-756型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；DGF-4AB型立式電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；Shimadzu AY-120型電子分析天平（日本島津公司）。

1.2材料5-羥色胺（批號：1130661-31205079，供含量測定用，由Sigma公司提供）；干蟾（批號：20101206，湖南省醫藥銷售有限公司提供），經湖南中醫藥大學藥學院劉塔斯教授鑒定；對二甲氨基苯甲醛、鹽酸等均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1吲哚類生物堿的含量測定［6］

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取5-羥色胺對照品0.0062g，置于10mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度。精密移取0.5m L置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（濃度為31μg／mL）。

2.1.2標準曲線的建立精密量取5-羥色胺對照品溶液0.5、1.5、2.5、3.5、5.0mL，分別置于10mL量瓶中，各加水至5mL，搖勻。加15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液（2→3）至刻度，搖勻，放置30min，照分光光度法，以水做空白對照（5mL水加5mL15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液，搖勻），在555nm的波長處測定吸光值。以5-羥色胺濃度（C）對吸光度（A）作標準曲線，得回歸方程為：A =0.0031C+0.0855（r=0.9996），提示5-羥色胺濃度在1.55～15.5μg／mL范圍內與吸收度線性關系良好。

2.1.3樣品溶液中吲哚類生物堿的含量測定精密量取各樣品溶液2mL，置于10mL量瓶中，依法顯色，測定吸光度，并計算含量。

2.2浸膏得率的測定精密吸取樣品液25mL，置于105℃已干燥至恒重（W1）的蒸發皿中，水浴蒸干，于105℃真空干燥3h，置干燥器中冷卻30min，迅速稱重（W2），按下列公式計算，即得。

浸膏得率%=［（W2-W1）×V提取液總）／（M干蟾×25）］×100%。其中：V提取液總表示提取液的總體積（mL），M干蟾表示每次投的干蟾的重量（mg）。

2.3提取工藝研究

2.3.1提取次數的考察稱取干蟾10g，加水浸泡0.5小時，加熱回流提取三次，加水量分別為10倍、8倍、8倍，提取時間分別為1.5h、1.0h、1.0h。分別收集各次提取液，定容，備用。取提取液，按前述方法分別測定吲哚類生物堿含量。結果表明，前兩次提取量占三次提取總量的73%，提示兩次提取不完全，因而需提取3次為宜。

2.3.2藥材粒徑的考察稱取干蟾10g，共三份，分別為最粗粉、粗粉、中粉，加水浸泡0.5小時，加熱回流提取三次，加水量分別為10倍、8倍、8倍，提取時間分別為1.5h、1.0h、1.0h。收集提取液，定容，備用。取提取液，按前述方法分別測定吲哚類生物堿含量。結果發現，最粗粉、粗粉、中粉的含量分別為1.128、1.322、1.319mg／g?？梢?，干蟾粉碎成粗粉時，吲哚類生物堿的浸出量較高，因而選擇粉碎成粗粉為宜。

2.3.3浸泡時間的考察稱取干蟾10g，粉碎成粗粉，共四份，各加水浸泡時間為0min、30min、60min、90min，加水倍量均為10倍、8倍、8倍，提取時間為1.5h、1.0h、1.0h，分別提取，收集提取液，按前述方法分別測定吲哚類生物堿含量。結果發現，加水浸泡0min、30min、60min、90 min時吲哚類生物堿含量分別為1.036、1.318、1.315、1.321mg／g?？梢?，干蟾藥材浸泡30 min左右時，總生物堿的浸出量較高，因而選擇浸泡30min為宜。

2.3.4U5*（53）均勻設計試驗［7］優選提取工藝依據單因素試驗考察結果，并考慮中藥提取工藝的主要影響因素，選擇提取時間、浸泡時間、加水倍量為考察因素，以吲哚類生物堿含量和浸膏得率為評價指標，用U5*（53）均勻設計表安排試驗（見表1），依法進行測定、計算（見表2）。

表1 U5*（53）均勻設計因素水平表

表2 U5*（53）均勻設計實驗結果

采用spss15.0統計軟件對上述均勻設計試驗結果運用后退回歸法進行回歸分析。加權值Y與因素X1、X2、X3關系的分析：以Y對X1、X2、X3及其交叉項進行后退回歸，得回歸方程：Y=63.346+0.197 X1X3。其復相關系數P=0.924；調整決定系數Ra=0.854；F= 17.495，P=0.025＜0.05。表明該方程具有統計學意義。方程中只保留了X1X3項，表明X1與X3存在一定的交互作用。X1X3的系數為正值，顯示與加權值呈正相關。

最佳提取條件的確定：根據上述相關性的分析，因素X1X3項的系數為正值，X1與X3均大于或等于0，當它們增大時，Y也增大。因此因素X1可定為最大值4.75h，X3可定為最大值38倍，代入方程，得方程Y=63.346+ 0.197 X1X3，計算出y的理論預測值為98.90。X2對Y沒有影響，為節約時間，提高效率，又使干蟾較充分潤濕，可將浸泡時間定為15min。因此，干蟾中吲哚類生物堿的最佳水提工藝為：加水浸泡15min，加水量分別為14倍、12倍、12倍，提取時間分別為100min、80min、80min。

2.3.5驗證試驗取3批干蟾藥材，每批100g，均按最佳水提工藝提取3次，分別測定吲哚類生物堿浸出量和浸膏得率（見表3）。結果表明，該工藝穩定、可行。

表3 驗證試驗結果

3討論

有關蟾蜍的藥用藥材有干蟾、蟾皮、蟾酥、蟾衣等，其中干蟾和蟾皮在市場流通過程中有混用現象，其化學成分和臨床應用研究報道較多，而有關其吲哚類生物堿的提取工藝研究較少。本試驗優選出了干蟾中吲哚類生物堿的最佳提取工藝條件，驗證試驗結果表明該工藝穩定、可行，可為其進一步的制劑開發和工業化生產提供參考。

本試驗中比色法測定的基本原理：吲哚類生物堿分子中的芳伯胺可與芳醛（如對二甲氨基苯甲醛）發生縮合反應，在酸性溶液中生成有色的希夫氏堿，此有色物質在某個波長處有明顯的吸收峰。試驗結果表明，此法專屬性強，方法靈敏，重現性好，操作簡便。在試驗過程中，發現樣品的最佳含量測定條件為：溫度控制在20℃以上，加入顯色劑后，樣品在20～30min內測定，吸收值穩定。

［1］中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥材第一冊［S］.1992：4.

［2］衛生部藥政管理局，中國藥品生物制品檢定所.中藥材手冊［M］.1990：629.

［3］張紹杰，劉誠進.淺談蟾蜍的藥用價值［J］.中華臨床醫學研究雜志，2007，13（10）：1397-1398.

［4］逯華，陳日新.華蟾素抗惡性腫瘤的研究進展［J］.右江民族醫學報，2009，1（5）：895-896.

［5］董巖，羅濛，姜同英，等.華蟾素注射乳劑的制備及制劑質量的研究［J］.沈陽藥科大學學報，2009，26（1）：6-9.

［6］王元清，嚴建業，喻林華，等.華蟾素分散片溶出度的研究［J］.中成藥，2008，30（11）：1667-1669.

［7］王元清，嚴建業，陳志文，等.均勻設計優選玉米須中總黃酮和多糖的水提工藝［J］.食品與機械，2010，136（2）：104-106.

Optimizing the water extracting conditions of Indole Alkaloids from Siccus Bufo by uniform design

LiWei1Wang Yuanqing2，3Yan Jianye2Luo Kun2?
（1 Xiangtan Central Hospital，Hunan Xiangtan provicine，411100，China；2 Key Lab of Modernization of Chinese Medicine，collega of Pharmacy，Hunan University of Chinese M edicine，Changsha 410208，China；3 Lab of Biotechnology and Engineering，College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

ObjectiveTo study the optimum extracting process for indole alkaloids from Siccus Bufo.MethodsThe extraction rate of extractum and extraction amount of indole alkaloids of Siccus Bufo were choosen as the assessment index，with solvent volume，macerating time and extracting time as examming factor，the optimum extraction progress was selected with the uniform design.ResultsThe optimum extraction progress conditions were as follows：macerated for 15 min in water，decocting for 3 times，with water of 14，12，12 times of the drug mixture respectively，105 min，80min，80min respectively.ConclusionThe extraction process of optimization can extract more indole alkaloids，and can provide the test foundation for production.

Siccus Bufo；uniform design；extraction process；indole alkaloids

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.04.091

：1672-2779（2014）-04-0144-03

蘇 玲 本文校對：林麗美

2013-11-06）

湖南中醫藥大學青年基金項目［No：99820001］；湖南省高?？萍紕撔聢F隊資助項目［No：湘教通（2010）212號］

*通訊作者