葡萄糖氧化酶雙試劑終點法測量模式的系統分析

高小文，孔花娟，李 筱，李雄海，柏 瑩，陳文華（陜西省漢中市中心醫院檢驗科 723000）

目前血清葡萄糖臨床實驗室測定有3種方法[1]：己糖激酶法、葡萄糖氧化酶法和葡萄糖氧電極法。另外還有床邊式血糖儀[2]，在臨床科室血糖監控中普遍應用。己糖激酶法是葡萄糖測定的參考方法[3]，但成本較高，臨床實驗室實際應用較少。葡萄糖氧電極法是近年來應用于臨床的快速檢測方法，自動化程度高，結果快速，需要特殊電極，成本較高，適合用于急診項目，是未來血糖檢測發展的方向，但實際應用不多。葡萄糖氧化酶法特異性不高，但在臨床廣泛應用于各診斷實驗室，血清葡萄糖氧化酶法在終點法中具有鮮明的特點，能充分體現終點法全自動生化分析不同測量模式下的表現形式。然而各試劑供應商給各級醫院提供的不同型號的全自動生化分析儀參數，普遍存在一些不合理的地方，加之設備廠家工程師對不同型號儀器參數設置也認識不夠，導致儀器的某些參數設置形同虛設，起不到應有的作用，給臨床個別標本的分析帶來很大的誤差，目前這一方面的問題報道較少[4]。本文以參數設置具有合理性和代表性的島津CL－8000全自動生化分析儀為例，系統地分析了血清葡萄糖氧化酶雙試劑終點法各種參數設置模式的優缺點，供臨床實驗室人員參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 選用當天門診患者血糖值在7.0、19.2、24.2 mmol／L的樣品3份，在高值血清中加純品葡萄糖粉自制1份特高值樣品。

1.2 儀器與試劑 日本島津CL－8000全自動生化分析儀。上海科華公司生產的雙試劑葡萄糖氧化酶法試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 設置島津CL－8000 5種模式相同的儀器參數 見表1。按表1所要求的不同條件，以每一個模式為一個測試項目，設置島津CL－8000生化分析儀的相關參數，5種模式相同的參數設置是：在Ready狀態下，進入Environment中將Automatic Rerun／Adding選為On，即打開自動重做功能。在Ready狀態下，進入Request將Automatic Rerun／Adding選中，此時凡符合自動重做條件的實驗項目即執行自動重做功能。在Ready狀態下，按照Parameter Test Master photometry選中項目GLU，進入Detail設置好樣品類型，單位，小數點，方法類型，波長；再進入Reagent Condition頁面進行試劑量的設定；進入Calibration頁面進行標準位置，定標類型等參數相關設定。然后進入Sampling Condition頁面進行樣品參數設定，在Sample vol 1中輸入4μL，2中輸入2μL；在Condition一欄中選中First Run，執行1；選中Above V－Range執行2；選中Super High執行2；選中Over Absortance執行2。再進入Range：Limit Condition頁面進行正常范圍，線性范圍，反應方向等參數的設定，尤其在Technical Limit選項中先選中Above再在Limit輸入限定的最高吸光度值。

表1 島津CL－8000對葡萄糖的不同標本處理分析

1.3.2 設置島津CL－8000 5種模式不同的儀器參數 模式1在Limit Condition頁面進行線性范圍設置時，設為0～24；在Technical Limit選項中在Limit項中輸入限定的最高吸光度值為1 100mAbs。模式2僅在模式1的基礎上將反應終點從33點延長到50點，使反應達到充分完全。模式3在Limit Condition頁面進行線性范圍設置時，設為試劑說明書提供的0～27.8的數據；在Technical Limit選項中在Limit項中輸入限定的最高吸光度值為2 500mAbs。另外在Sampling Condition頁面進行樣品參數設定時，在Sample vol 1中輸入4μL，在Condition一欄中選中First Run，執行1，其余不設置。模式4僅在模式1的基礎上在Technical Limit選項的Limit項中輸入限定的最高吸光度值為2 500mAbs，使線性范圍最高值24成為有效的限制參數。模式5在模式1的基礎上在Limit Condition頁面進行線性范圍設置時，設為試劑說明書提供的0～27.8；使Limit項中輸入限定的最高吸光度值1 100mAbs為有效的限制參數。

1.3.3 用5種模式對4種不同的樣品進行分析 將4種不同的樣品放置在樣品盤上，對每一份樣品均采用以上5種模式進行分析，直到樣品狀態顯示完成為止。每一份樣品重復測3次，結果取均值。

2 結 果

2.1 對自制特高值血清標本，觀察和評價5種模式具體的數據和反應曲線，結果見表2。模式1、4、5的限制參數均發揮作用，提示出超限，并執行2的減量測定，結果理想，同時各種模式對此標本均表現出底物耗盡現象，但模式2和模式3未發現和提示出此種現象，存在參數缺陷，實際測定數據誤差也較大。

表2 不同模式對特高濃度血糖測定的結果（mmol／L）

2.2 選出血糖值在7.0、19.2、24.2mmol／L水平的樣品3份，每一份樣品重復測3次，測試結果取均值見表3。數據顯示7.0mmol／L和19.2mmol／L的標本5種模式均能準確測定。24.2mmol／L標本模式3存在參數缺陷，導致結果誤差較大。

表3 不同模式對不同濃度血糖測定的結果（mmol／L）

3 討 論

目前臨床生化檢驗自動化程度越來越高，幾乎全部采用各試劑廠家的成品試劑，但是我國體外診斷試劑的現狀與國際上相比，無論質量還是監管都有一定的差距[5]，提供的實驗參數缺乏科學性，如焦連亭[6]報道的如果對分析化學、酶動力學和對儀器性能沒有一定的掌握，是很難設置好參數的。要根據各實驗項目在臨床上的具體情況，各種儀器的性能特點，合理設置。這就要求設備廠家工程師對設備的各種參數和性能必須熟悉，并得到恰當的應用。同時試劑廠家對所生產的試劑一定要作出科學的評價，尤其是試劑吸光度A值的最低和最高檢測限額以及空白A值、線性范圍等限制參數必須與實際情況相符。

在儀器方面，有些儀器為了提高檢測速度，樣品在第一次加樣后即退出軌道，僅對結果的高值和超限提出報警，由實驗人員對標本進行稀釋重測。有些儀器考慮到標本的稀釋重做，采用圓盤式樣品加樣，同時增設自動稀釋重做功能，能很好地完成對每一份樣品的測定，具有代表性的就是日立和島津系列。

在終點法的設置時，有些項目反應很快達到終點，顯色穩定。比如三酰甘油、總膽固醇、尿酸等，可以縮短讀點。但有的項目反應慢，在儀器的一般設定時間內，達不到終點，特高值樣品顯色后又不穩定，表現出底物耗盡現象。對此類試驗一方面除盡可能地延長反應時間，讓反應達到完全外[7]，還應注意到底物耗盡的現象，尤其以葡萄糖氧化酶法測定最具代表性。越是特高值的樣品，底物耗盡現象引入的誤差越大，此種情況在糖耐量實驗中表現最為突出。也有對葡萄糖氧化酶法一點終點法進行改良的報道[8]，即在不改變樣品與試劑比例的前提下，將樣品與試劑各減半混合，在儀器測光前（終點前）加入等量的水稀釋混勻，再測定其吸光度。測定線性范圍較寬，一般不需對高濃度標本進行稀釋。還有將終點法改良為兩點法的報道[9]。

本組研究設置模式2，以實現延長反應時間，使反應達到終點的目的，同時對線性高值和吸光度A值最高限額進行了有效限制。對正常標本和稍高值的標本效果很好，但在對特高值樣品測定時，發現反應曲線呈拋物線狀降低，表現出底物耗盡的現象，并引入較大的誤差，應引起同行的重視。在本研究設置的模式4中單獨對線性高值進行了有效限制，使超出線性范圍的標本均起到了報警和自動減量重做的作用，結果的準確性得到了保證。在設置的模式5中單獨對吸光度A值最高限額進行了有效限制，同樣對超限標本均起到了報警和自動減量重做，進一步驗證了在日常工作中采用的模式1的科學性和正確性。模式1也是目前作者認為在實際應用中最為理想的分析模式，它充分利用了有效的線性限制和吸光度A值最高限額，對不同濃度的標本均能實現準確測定。對于模式3設置的線性限制和吸光度A值最高限額，均未起到任何限制作用，從本次葡萄糖氧化酶法結果分析，反映出試劑廠家提供的線性范圍為27.8mmol／L，而實際在24.5mmol／L左右已達到線性極限，同時試劑廠家提供的吸光度A值最高檢測限額ABS＝2 500mAbs，在CL－8000上僅測到1 300～1 400mAbs，導致模式3所設置的限制參數起不到任何作用，給高值樣品的檢測帶來很大的偏差[10]。這種模式個別工程師經常用，應引起注意。

因此要求廣大的臨床檢驗人員，在實際工作中不要一味依賴廠家提供的各種參數，要正確分析，合理利用廠家提供的限制參數和試劑比例[11]，注意一些干擾因素[12]，確保對各種標本分析結果的準確性。

[1]費維倫，梁春陽.3種血清葡萄糖測定方法的比較[J].檢驗醫學與臨床，2012，9（20）：2573－2574.

[2]朱海燕，蘇猛.對干化學方法快速測定血糖結果的評價[J].中外醫學研究，2013，11（6）：66.

[3]謝服役，孫琦，吳巧萍.參考方法測定血清葡萄糖的測量不確定度評價[J].浙江醫學，2013，35（3）：188－191.

[4]耿素珍.生化自動分析儀反應監測與葡萄糖測定質量控制[J].河北北方學院學報：醫學版，2009，26（1）：53－56.

[5]李海寧，母瑞紅，任海萍，等.體外診斷試劑監管現狀分析及思考[J].中國醫療器械雜志，2011，35（1）：68－70.

[6]焦連亭.我國生化分析儀臨床應用中應注意的若干問題[J].中華檢驗醫學雜志，2005，28（5）：472－474.

[7]王翠玉，段櫻.終點法反應平衡時間的試驗觀察[J].陜西醫學檢驗，2002，17（1）：33－34.

[8]黃健，張劉冬.改良終點法在臨床生化檢驗中的應用探討[J].海南醫學，2010，21（22）：46－47.

[9]趙燕霞，孫光偉.兩點法在血糖測定中的應用[J].實用醫技雜志，2007，14（18）：2411－2412.

[10]王寶占，李立和.葡萄糖測定參數設置與質量保證[J].現代檢驗醫學雜志，2009，24（6）：81－82.

[11]韓鵬飛，蔡娟.血清葡萄糖測定在不同試劑／樣本比例下的線性實驗[J].檢驗醫學，2010，25（4）：314－316.

[12]張亞男.血清葡萄糖測定臨床意義[J].中國現代藥物應用，2012，6（9）：43－44.