惡性疾病導致ABO血型抗原或抗體減弱的討論＊

聶益軍（南昌大學第一附屬醫院檢驗科細胞室，南昌 330006）

血型是指各種血液成分（包括紅細胞、白細胞、血小板等）的遺傳多態性，ABO血型為人類紅細胞的表面抗原，是一種穩定的遺傳標記。正常情況下，血型的遺傳標記不會改變，但某些疾病（白血病、惡性腫瘤等）會引起ABO血型抗原或其血清抗體減弱，導致暫時性的“血型變異”，從而難以及時、準確地對ABO血型進行鑒定。由于疾病對ABO血型的影響多局限于免疫血清學，而發生在基因水平上的改變概率較小，因此基因分型是正確鑒定血型不可或缺的輔助手段。現將所涉及抗原及抗體減弱的案例舉例說明并加以分析討論。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者標本來源于南昌大學第一附屬醫院2011～2012年ABO血型抗原或抗體減弱的臨床標本，共計27例，發病年齡15～62歲，血型鑒定前3個月均無輸血史。其中男14例，女13例；惡性腫瘤導致的ABO血型抗原或抗體減弱的臨床標本10例，白血病導致的ABO血型抗原或抗體減弱的臨床標本17例；ABO血型抗原減弱的19例，ABO血型抗體減弱的8例。分別選取A型和B型抗原減弱各1例，O型抗體減弱兩例進行探討分析。

1.2 儀器與試劑 單克隆抗－A，抗－B，ABO試劑紅細胞均由上海血液生物制品提供，離心機為日本久保田KA－2200臺式離心機；DNA提取試劑Gene One Technology（美國產）；人類ABO血型基因檢測試劑盒[序列特異性引物聚合酶鏈反應（PCR－SSP法）]為天津秀鵬產品；9700擴增儀（美國ABI公司）；凝膠成像儀（美國BIO－RAD）。

1.3 方法

1.3.1 ABO血型血清學鑒定 ABO血型鑒定為正、反定型，均采用試管法，具體操作見《中國輸血技術操作規程》。

1.3.2 ABO血型基因學鑒定（PCR－SSP法）

1.3.2.1 DNA提取 900μL的溶液L1及300μL的全血振蕩后離心棄上清液，振蕩以打破核細胞團。加入200μL L2 Buffer，振蕩后將溶解物放入離心柱子中離心并棄去過濾液。加入400μL溶液W1到離心柱子中，離心并棄去過濾液。加入600μL溶液W2到離心柱子中，離心并棄去過濾液。將離心柱子轉移另一干凈的離心管中，加入Elution Buffer（60～65℃），浸泡1min后離心30s，移去離心柱子，獲得DNA。

1.3.2.2 加樣 44μL dNTP－Buffer＋56μL純水＋0.8 μLTaq酶（5U／μL）＋10μLDNA。

1.3.2.3 擴增 96℃，2min；1個循環→96℃，20s；68℃，60s；5個循環→96℃，20s；65℃，45s；72℃，30s；15個循環→96℃，20s；62℃，45s；72℃，30s；15個循環→72℃，3 min；→4℃保存。

1.3.3 電泳 擴增產物電泳并根據格局表判定結果。

1.3.4 判定標準

1.3.4.1 ABO血型抗原減弱的判定 患者紅細胞與單克隆抗－A和（或）抗－B反應凝集強度未達到（＋＋＋）者，包括出現混合凝集時均判定為ABO抗原減弱[1]。

1.3.4.2 ABO血型抗體減弱的判定 用標準A細胞和（或）B紅細胞與患者血清反應，凡室溫反應低于或等于（＋）凝集者均判定為ABO抗體減弱[1]。

1.3.4.3 ABO血型基因學方法 采用PCR－SSP，擴增產物電泳后在紫外燈下兩個條帶為陽性，只有一個條帶為陰性（內對照）。根據格局反應判定血型。

2 結 果

2.1 試驗結果4例血清學試驗結果 見表1。

表1 血清學試驗結果

圖1 基因學電泳圖像

2.2 基因學電泳圖像 例1和例2的基因學電泳圖像見圖1。

3 討 論

ABO血型是人類最重要的一個血型系統，其檢測多采用血清學正反定型方法，任何影響抗原或抗體改變的因素均可干擾ABO血型定型的結果。1957年Van Loghem等[2]首先報道了急性粒細胞白血病（AML）患者A抗原減弱，國內也有相關血液疾病導致ABO血型抗原減弱的報道[3－4]。但目前白血病及其他一些血液病導致紅細胞ABO血型抗原減弱的原因及確切機制尚未明確，國內外學者普遍認為與下列因素有關：（1）與體內血型基因突變有關聯。ABO血型抗原基因位于9號染色體，位于同一染色體的病毒致癌基因c－abl可干擾ABO基因的合成，導致患者紅細胞A和（或）B抗原減弱。又由于基因突變也可導致糖基轉移酶活性降低，使H抗原轉變為A或B抗原的過程阻斷，而導致血型抗原減弱。（2）粒細胞白血病患者粒細胞異常增生，使紅系細胞增生相對受到抑制，其紅細胞的代謝受到干擾，紅系增生受抑，造成A、B、H抗原物質減弱。（3）也可能與體內唾液黏蛋白產生過多，遮蓋了紅細胞表面的抗原部位而導致血型抗原強度變化有關。近年來的研究更多地放在分子生物學的調控機制上，認為在啟動子區CpG島內發現啟動子附近有多個特異性半甲基化位點，可能是引起ABO抗原弱表達的原因[5]。有研究表明，造成ABO血型抗原減弱的原因是ABO基因位于人類第9號染色體上，其啟動子區域富含CpG島。ABO基因的表達受到近端啟動子甲基化程度的影響，甲基化程度越高，ABO基因的表達就越不活躍，從而導致A、B抗原表達減少[6]。2009年有研究檢測了21例患者的ABO位點拷貝數及DNA甲基化變化，其中11例存在1個或2個ABO等位基因表達缺失，另10例患者未檢測到ABO mRNA等位基因表達缺失。而在這11例ABO等位基因表達缺失的患者中，有8例（73%）的ABO基因啟動子存在甲基化狀態[7]。此外，基因突變、染色體易位也可能使血型基因丟失或被掩蓋[8]。

本次研究對象中有19例抗原表達減弱，減弱程度從±至＋＋不等（與單克隆抗－A和（或）抗－B反應的凝集程度），這其中有12例為白血病患者，7例為腫瘤患者。白血病患者抗原減弱可能是由于粒細胞的異常增生導致紅系增生受抑造成。而腫瘤患者可能與蛋白分泌過多有關。同時本研究發現幾乎所有急性白血病造成的ABO抗原減弱，在試管法檢測中均表現為混合凝集視野。這是由于疾病在急性發作之前或緩解之后患者紅細胞上的抗原相對正常，而急性發作期間紅細胞上的ABO抗原急劇減弱所形成的現象[1]。

惡性腫瘤疾病造成抗體減弱可能是由于3方面原因：（1）放化療時造成的機體正常免疫功能受到破壞；（2）腫瘤細胞的大量生長抑制了正常免疫細胞的活性；（3）大量失血。

本次研究對象中有8例血清抗體減弱，這是由于疾病、化療等造成機體各大器官衰竭，體內免疫系統抑制，影響了免疫應答過程，使體液免疫、細胞免疫甚至固有免疫水平下降，出現嚴重感染或機會性感染就會大大增加，感染又會加重免疫抑制，進而使B淋巴細胞活化、增殖、分化的某一個階段出現異常，抑制漿細胞生成，引起抗體水平下降。但令人關注的是同樣為O型患者表現的抗體減弱形式也不盡相同。O型患者抗體減弱可以表現為抗－A和抗－B同時減弱，因為O型個體的抗－AB不是抗－A和抗－B的混合物，抗－AB識別的是A抗原和B抗原上共同的表位。O型患者也可變現為抗－A或抗－B的單獨減弱，可能是因為機體免疫系統受到侵害造成免疫球蛋白低下，進而使得免疫球蛋白分泌紊亂而造成抗－A或抗－B的單獨減弱。也可能是一種免疫耐受現象，在其胚胎發育早期接觸母體的A或B型抗原物質，經胎盤流入體內，反復刺激而發生免疫耐受現象，致使機體對該抗原不能產生免疫反應而相應地不產生抗－A或抗－B[9]。

由于疾病對ABO血型的影響多局限于免疫血清學，而發生在基因水平上的改變概率較小，因此基因分型是正確鑒定血型不可或缺的輔助手段。隨著分子生物學技術的發展，檢測基因結構的方法不斷涌現，尤其是與PCR技術結合的檢測技術進一步推動了基因研究的發展。紅細胞血型分子生物學有多種，包括PCR－SSP、序列特異性寡核苷酸探針聚合酶鏈反應（PCR－SSOP）、聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性（PCRRFLP）、PCR－DNA測序、基因芯片等[10]。本次試驗研究中，對于ABO血型抗原或抗體減弱的確定就是通過ABO基因分型最終確定的，作者采用PCR－SSP法，其優點在于操作簡便、結果直觀（圖1所示）。序列特異性引物引導的PCR反應（PCRSSP法）的原理是根據不同類型核心序列關鍵幾處堿基的差異設計一系列具有等位基因序列特異性的引物，從對應類型的核心序列起始擴增，直接擴增具有各種序列差異的等位基因特異性片段。PCR產物經電泳分離可以呈現不同的擴增片段圖譜從而分析判定標本的基因型。用分子生物學分型技術對紅細胞抗原的基因型作鑒定其圖像直觀而清晰，同時還可以不受血清中自身抗體、不規則抗體、疾病和假、弱凝集的影響，對保證臨床安全輸血具有重要意義。

總之，ABO血型抗原減弱血清學試驗多表現為混合凝集；O型個體抗體減弱可以表現為單一抗體減弱也可表現為抗－A及抗－B抗體同時減弱。對于在疾病發作期而難以正確定型的患者可進行ABO分子生物學試驗，從基因型上確定患者ABO血型。必要時，可待患者疾病緩解后復查ABO血型，以便給患者一個真實、明確的ABO血型結果，為今后的臨床輸血提供支持和保障。

[1]金沙，向東，劉曦，等.疾病導致ABO血型抗原及抗體減弱的分析[J].臨床輸血與檢驗，2010，12（1）：61－62.

[2]Van Loghem JJ，Dor fmeier H，Vander Hart M.Two Antigens with abnormal serologic properties[J].Vox Sang，1957，2（1）：16－24.

[3]王湘屏.1例白血病患者血型抗原減弱、抗體缺失[J].中國檢驗醫學與臨床，2003，4（2）：74.

[4]黃菲，李翠瑩，甘新宇，等.白血病致ABO血型抗原減弱4例[J].中國輸血雜志，2011，24（1）：67－68.

[5]應燕玲，陶蘇丹，和艷敏，等.一例ABO血型系統B抗原減弱表達的分子機制[J].中華醫學遺傳學雜志，2011，28（4）：397－400.

[6]Kominato Y，Hata Y，Takizawa H，et al.Expression of human histoblood group ABO genes is dependent upon DNA methylation of the promoter region[J].J Biol Chem，1999，274（52）：37240－37250.

[7]Bianco－Miotto T，Hussey JD，Day KT，et al.DNA Methylation of the ABO promoter underlies loss of ABO allelic expression in a significant proportion of leukemic patients[J].PLoS One，2009，4（3）：e4788－e4791.

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[10]胡麗華.臨床輸血學檢驗[M].3版.北京：人民衛生出版社，2012：61－62.