獻血者血液單人份核酸檢測及血清學檢測結果的分析

劉峭梅覃柳燕（廣西壯族自治區血液中心，廣西柳州 545005）

隨著血液檢測技術的不斷更新，核酸檢測（NAT）技術作為一種新的血液病毒篩查檢測技術，由于可以直接檢測到病原體的核酸，檢測靈敏度高、特異好，可大大縮短檢測“窗口期”，能夠有效地降低經輸血途徑傳播病毒的風險。在我國，已有一些血液中心和中心血站近幾年在血液篩查中引入NAT技術，該技術的引入對保證血液的安全性起到了很大的作用。本中心從2012年9月引進了諾華診斷的Procleix TIGRIS System血液篩查系統，通過3個月的調試安裝和培訓后于2012年12月起對柳州地區無償獻血者的血液標本進行NAT，現在的檢測模式為2個不同生產廠家的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑和1種核酸試劑同時并行檢測，對檢測為NAT（＋）ELISA（－）的標本進行鑒別試驗。我國2012版《血站技術操作規程》中對HBV、HCV、HIV標志物及其檢測方法可有兩種選擇，一種是繼續采用2個不同生產廠家的ELISA試劑檢測，另一種選擇是1種ELISA試劑和1種核酸試劑檢測。作者對本單位2012年12月1日至2013年4月30日采集的18 236份無償獻血者血液標本NAT和ELISA的檢測結果以及核酸鑒別試驗結果進行比較分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集 2012年12月1日至2013年4月30日本中心采集的柳州地區無償獻血者的血液標本18 236份，獻血者均符合獻血者健康檢查要求。每位獻血者留取2管標本，分別為5mL的二乙胺四乙酸四鉀（EDTA－K2）真空采血管（浙江拱東）和5mL的EDTA－K2分離膠真空采血管（上?？迫A），其中不含分離膠的采血管用于ELISA檢測，而含有分離膠的用于NAT檢測。NAT管采集后在4h內離心，各檢測在標本采集后48h內完成，不能完成的－20℃密閉保存，7d內檢測。

1.2 儀器與試劑 EVO全自動標本處理系統；FAME24／30全自動酶免分析系統；諾華Procleix TIGRIS NAT系統（美國Novartis）；乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）（1家國產試劑和1家進口試劑）；抗－HCV（2家國產試劑）；抗－HIV（1家國產試劑）；HIV Ag／Ab（1家進口試劑）；HIV－1RNA、HCV RNA、HBV DNA三聯檢核酸試劑（Procleix UltrioAssay）；HIV－1 RNA鑒 別 試 劑（Procleix HIV－1DiscriminatoryProbe Reagents）；HCV RNA鑒別試劑（Procleix HCV Discriminatory Probe Reagents）；HBV DNA鑒別試劑（Procleix HBV Discriminatory Probe Reagents）。所有使用的試劑均為合格試劑且在試劑有效期內使用；所有的儀器均按儀器的要求進行保養和維護，并確保儀器在正常工作狀態下運轉。

1.3 方法 （1）ELISA檢測：將采血管按要求進行離心，ELISA試劑室溫平衡后使用EVO一次性加樣針進行全自動加樣，采用FAME 24／30全自動酶免分析系統進行全自動處理。ELISA兩種試劑使用不同的加樣系統、不同的分析系統同時檢測，按各試劑的檢測標準、操作規程進行操作。ELISA兩種試劑均無反應性的標本判定ELISA陰性，兩種試劑均有反應性的標本判定ELISA陽性；只有單一種ELISA試劑有反應性的標本需進行原試劑雙孔復試，復試雙孔中有一孔或雙孔有反應性的標本判定ELISA陽性，否則判定ELISA陰性。（2）單人份NAT：與ELISA檢測平行進行。將含有EDTA－K2分離膠真空采血管按要求進行離心，應用Procleix TIGRIS System血液篩查系統ID－NAT檢測模式，采用ULTRIO篩查試劑進行HIV－1RNA、HCV RNA、HBV DNA三聯檢NAT，篩查無反應性的標本為NAT陰性，篩查有反應性的標本為NAT陽性；篩查有反應性但ELISA檢測為陰性的標本，用鑒別試劑進行鑒別確定反應性的項目。

2 結 果

2.1 共18 236份標本，對HBV／HCV／HIV標志物使用NAT與ELISA平行檢測，結果NAT陽性標本181份，ELISA陽性246份，其中NAT陽性且ELISA陽性標本117份，NAT陽性且ELISA陰性的標本64份，ELISA陽性且NAT陰性標本129份。結果見表1。

表1 18 236份標本NAT、ELISA并行檢測結果[n（%）]

2.2 117份NAT陽性且ELISA陽性標本中，HBsAg陽性100份，占85.47%，其中國產試劑90份，進口試劑100份；抗－HCV陽性12份，占10.25%，國產試劑1為12份，國產試劑2為11份；抗－HIV陽性7份，占5.98%，國產試劑，進口試劑均能檢出。7份NAT陽性且抗－HIV陽性標本經疾病預防控制中心（CDC）確證為HIV陽性。

2.3 64份NAT陽性ELISA為陰性標本經鑒別試劑鑒別后，HBV DNA（＋）為18份，HCV RNA（＋）0份，HIV RNA（＋）0份，鑒別陽性率為28.13%。

2.4 129份NAT陰性ELISA陽性標本中，HBsAg陽性53份，其中國產試劑37份，進口試劑39份，23份為兩種試劑均為陽性；抗－HCV陽性40份，國產試劑1為32份，國產試劑2為11份，有3份為兩種試劑均為陽性；抗－HIV陽性31份，其中，國產試劑5份，進口試劑26份。

3 討 論

3.1 從表1中看到18 236份標本的檢測結果中發現NAT陽性標本181份，ELISA陽性246份，NAT和ELISA都能夠有效地檢測出不合格標本，但兩個檢測系統檢出的陽性標本并不完全相同，只選擇其中一個都存在著漏檢的可能。從文中看到117份NAT（＋）、ELISA（＋）的標本中100份為HBsAg（＋）占85.47%，12份抗－HCV（＋），7份抗－HIV（＋）。表明在獻血者血液中不合格的項目仍然是HBV。

3.2 從文中看到18 236份標本中檢出64份NAT（＋）ELISA（－）的標本，鑒別出18份HBV DNA（＋），HBV漏檢率0.99‰。HIV RNA和HCV RNA檢出為0，與國內許多血站報道相一致。HBV 0.99‰的漏檢率與周邊幾個城市例如東莞0.9‰[1]，常州1.0‰[2]，南京0.99‰[3]，寶雞1.14‰[4]相近。值得注意的是在鑒別64份標本中，有46份HBV／HCV／HIV鑒別試驗為陰性，比例高達71.87%。這些標本有可能為NAT假陽性也有可能是病毒水平太低造成鑒別試驗為陰性。姚鳳蘭等[5]報道認為單人份NAT檢測時常規篩查檢測出的陽性標本不能被鑒別是哪種病毒陽性，大多數并非NAT假陽性而是真陽性，之所以無法鑒別的原因是因為病毒水平太低。利用超速離心技術對NAT篩查陽性鑒別試驗為陰性的標本進行鑒別，使76.6%（23／30）的常規不能鑒別的標本得到鑒別，確定為HBV[6]。由此可見現所采用的兩種試劑檢測HB－sAg均存著HBV漏檢的現象，NAT有利于提高乙型肝炎病毒的檢測能力。

3.3 對于129份NAT（－）ELISA（＋）的標本，從文中看到HBsAg雙試劑陽性23份，抗－HCV雙試劑陽性3份，103份為ELISA單試劑陽性。對這些標本由于沒有進行中和試驗或其他的確證試驗，也沒有進行乙型肝炎病毒標志物的相關檢測，因此無法鑒別所有的標本是不是真正的陽性標本，存在著ELISA假陽性的可能，但也存在著由于獻血者血液中病毒載量很低，低于NAT的檢出水平或病毒處在靜默期，導致NAT假陰性的可能。有報道，機體的長期病毒感染導致血液中抗體或抗原滴度很高，不影響ELISA的檢出，但血液中存在的HB－sAg是由病毒DNA整合到人染色體與宿主基因共同表達所致，所以檢測不到血清中病毒HBV DNA[6]，造成NAT漏檢。

3.4 從文中看到現有的兩種ELISA試劑檢出的陽性數是各不相同的。由于不同的ELISA試劑生產廠家包被的抗原、抗體片段不同或酶標抗體的濃度以及對酶標活性的保護方面采取的方法不同，造成各檢測試劑的特異性、靈敏度有所不同。從表中看到進口試劑的靈敏度比國產試劑的靈敏度要高，檢出的標本陽性率比國產試劑要高，但兩種ELISA試劑中去掉任何一種都有漏檢測的可能。

綜上所述，NAT檢測方法能夠檢測出因“窗口期”感染、免疫靜默期感染、病毒變異等原因而漏檢的污染血液[7]，特別對乙型肝炎病毒的檢測能力有很大的提高，有條件的采供血單位應開展NAT血液篩查，降低經輸血途徑傳播病毒的風險。但也注意到ELISA可以檢測出那些病毒載量低的慢性或持續性感染以及處在病毒靜默期感染的標本。WHO《血液篩查建議書》（2009）中建議在考慮將NAT列入篩查策略之前，應首先保證已經有效建立具有質量保證的血清學篩查技術，并對所有的血液實施篩查[8]。從理論上，NAT檢測的是病毒核酸，ELISA檢測的是病毒抗原或抗體，兩者在檢測原理及方法上存在差異，因此這兩個方法對血液標本的檢測都很重要但不是重復而是互相補充，不存在誰替代誰，這兩者都應作為血液篩查檢測中的重要環節。在選擇兩種ELISA檢測策略中應對ELISA試劑進行考評，盡量選擇兩種互補性強的試劑，并建議在選擇HBsAg試劑時選擇高靈敏度、特異性強的進口試劑；在實施NAT后去掉2種ELISA試劑中的任何一種均存在一定的漏檢可能，去掉哪種ELISA試劑，需要進行風險效益評估。

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[3]蔣呢真，黃成垠，肖那平，等.獻血者HBV HCV HIV的單人份核酸檢測[J].臨床輸血與檢驗，2010，12（3）：208－210.

[4]李晶，周艷，丁衛平，等.核酸檢測技術在寶雞地區血液篩查中的應用[J].中國輸血雜志，2012，25（8）：784－786

[5]姚鳳蘭，任芙蓉，王卓妍，等.超離心濃縮對提高血液NAT篩查不確定標本鑒別率的臨床研究[J].北京醫學，2009，31（11）：687－690

[6]李金明.臨床酶免疫測定技術[M].北京：人民軍醫出版社，2006：187－196.

[7]顏秀娟，陸祝選，邱昌文，等.核酸檢測技術應用于血清學篩查合格的獻血者標本檢測[J].中國輸血雜志，2012，25（12）：1322－1324.

[8]郭永建，池泉，涂東晉，等.WHO血液篩查建議書主要內容介紹[J].中國輸血雜志，2010，23（1）：66－72.