BD Influx流式細胞分選儀參數調試和最佳條件的設定*

梁昊岳 楊晚竹 程雪蓮 紀 慶 張 峴 王金宏*

BD Influx流式細胞分選儀參數調試和最佳條件的設定*

梁昊岳① 楊晚竹① 程雪蓮① 紀 慶① 張 峴① 王金宏①*

目的：探索BD Influx流式細胞儀分選細胞亞群的調試參數和最佳設定條件。方法：使用兩種質控試劑Rainbow Beads和Accudrop Beads作為實驗材料，對BD Influx流式細胞儀的針孔、液流、熒光通道、前向角散射光信號、液滴頻率、振幅和液滴延遲等參數進行優化。結果：使用型號為100 μm的噴嘴，在液流聚焦清楚、液柱打入廢液收集管的正中央、熒光光斑進入針孔中央且最亮、前向角散射(FSC)光光斑進入針孔中央且最亮、斷點最高、液流分叉呈穩定的亮點、振幅為5.20±1.00以及液滴延遲為35.20±2.00等最佳設定條件下，其細胞樣本分選純度可達99%，工作效率可達95%。結論：流式細胞儀分選參數條件的設定，可為獲得高純度、高活性的細胞提供快速調試方法。

流式細胞術；細胞分選；分選參數；最佳條件

[First-author’s address] State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology & Blood Disease Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China.

流式細胞術在免疫學、腫瘤學及血液學等方面的應用已獲得廣泛認可和關注[1-4]。在藥物高通量篩選方面，流式細胞儀發揮著重要作用[5]。因其具有準確、靈活、快速、靈敏、高通量和多參數同時分析等優點，已成為細胞生物學研究的重要手段。20世紀80年代初最先研制出了穩定性能良好的流式細胞儀，近年來，隨著流式細胞儀的功能不斷地進步，其分析軟件的功能更加強大，為服務于臨床和基礎研究提供了有力的保證[6]。

BD Influx分選型流式細胞儀是目前高端流式細胞儀之一，Influx具有模塊化結構，強大的檢測能力和高性能的分選功能。該型號儀器可多熒光、多參數定量分析及無菌高速分選，具有消耗鞘液量少、分選速度快及分選后細胞活性高等特點，并采用空氣中激發和分選，使分析分選的全過程始終處于同一空氣介質中，確保液流的穩定性和檢測的準確性。與其他型號細胞分選儀相比，Influx在設計上提供了更多的調試空間。使用流式細胞儀進行分選前，儀器最佳條件的設定和參數的調試直接關系到分選的成敗，且高質量地完成儀器參數的調試直接關系到分選的效率、純度及回收率等結果，尤其是微孔板單細胞分選[7]。

1 材料與方法

1.1 設備與材料

BD Influx分選型流式細胞儀；Heraeus labofuge 400R離心機；Accudrop beads、Rainbow beads均為美國Becton Dickinson公司出品；PerCP-Cy5.5標記的抗人CD4抗體(美國Becton Dickinson公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)，1×PBS鞘液，牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩沖液(pH值為7.4，含1%牛血清白蛋白)。

1.2 方法

(1)樣品制備。將Rainbow beads和Accudrop beads用無菌鞘液稀釋備用，取從EDTA抗凝血中分離的外周血單個核細胞，使用PerCP-Cy5.5標記的抗人CD4抗體染色(每106外周血單個核細胞加抗體2 μl)，避光30 min后用2 ml磷酸緩沖液洗滌細胞，400 g/min離心5 min(1800 r/min)，重懸于0.4 ml的PBS/BSA溶液，2 h內上機分析和分選。

(2)系統啟動。倒空廢液桶、蓋好鞘液桶和廢液桶蓋后依次打開主電源、真空泵、空氣壓縮機以及流式細胞儀的電子系統、計算機、激光開關、加壓閥和FACS軟件，關閉放氣閥。

(3)液流啟動。①鞘液充滿液路：取下噴嘴在其孔下放置沖洗槽，按Rinse鍵打開液流，30 s后關閉液流，反復開關數次使鞘液充滿液路；②清洗及安裝噴嘴：將噴嘴放于裝有去離子水的超聲波清洗機中超聲1～2 min，使用裝有0.22 μm無菌濾器的注射器沿液流相反方向沖洗噴嘴，然后沿液流相同方向沖洗噴嘴，若注射器打出的液流呈直線狀，則噴嘴清洗完成，將噴嘴重新安裝到機器上并擰緊，確保O型圈密封好；③反沖及排氣泡：將排氣泡貯水匙放置在沖洗槽上，匙中裝滿去離子水使噴嘴的底部尖端沒入液面以下。按Purge鍵使氣泡隨液流而流走，當貯水匙中充滿水時反復按Purge數次。也可在不放置貯水匙的條件下，先按Purge鍵產生一段氣泡，再放置貯水匙，用水將氣泡排走。排氣泡結束后按Run鍵打開液流，檢查液流是否垂直，如不垂直，需重新清洗噴嘴和排氣泡。打開液流后移開進樣針位置處流式管，按Backflush鍵反沖30 s。

(4)校準針孔和液流。打開液流，調節旋鈕使鞘液壓力為0.118 MPa，樣品壓力為0.125 MPa。調節噴嘴上方有3個互相垂直的銀色旋鈕，經針孔顯示屏觀察，調節X軸旋鈕使液流聚焦清楚，調節Y軸旋鈕使液流移至針孔中央，Z軸不調。調節噴嘴上方的兩個互相垂直的黑色旋鈕，經Stream顯示屏觀察，調節前后旋鈕使噴嘴前后擺動，調節左右旋鈕使噴嘴左右擺動。調節后使液柱打入廢液收集管的正中央，且Stream顯示屏中圓球狀亮點達到小且亮為宜。反復調節上述兩套旋鈕使條件為最優。

(5)優化488 nm激光熒光通道。打開FACS軟件，將所有參數選擇為線性，畫一個散點圖，橫坐標為530/40[488]，縱坐標為580/30[488]，閾值探測器選擇530/40[488]，打開機器左側的488 nm激光shutter，同時關閉其他激光的shutter。關閉噴嘴小室門用手指點擊小室門右上方的探測器后可觀察到488 nm激光已打開。樣品上機Rainbow beads，按Sample鍵開始進樣品，開始數秒如上樣速度慢可按Boost鍵加速進樣，最終流速保持在100～200個/s細胞樣品。觀察針孔顯示屏，調節488 nm激光的Z軸和噴嘴上方的Y軸銀色旋鈕，使光斑進入第1個針孔中央，調節488 nm激光的Y軸和噴嘴上方Y軸銀色旋鈕，使針孔中的光斑最亮，同時散點圖中信號達到最強，變異系數(coefficient of variation，CV)值最小。

惡性淋巴瘤是血液科的常見疾病，在淋巴瘤的治療過程中，發熱是比較常見的現象，發熱的原因有很多，如癌性發熱、感染性發熱、免疫因素引起的發熱等，每一種發熱的處理方法不一樣，能否及時有效地處理淋巴瘤患者的發熱問題，直接關系到了淋巴瘤患者的生存預后。中西醫學在處理淋巴瘤發熱問題上各有其獨特的方法，筆者長期從事于惡性血液病的中西醫結合治療，對淋巴瘤發熱問題的中西醫學認識談談自己的一點體會。

(6)優化前向角散射光信號。畫1個散點圖，橫坐標為FSC，縱坐標為SSC，將針孔顯示器轉換為Video2，上樣過程參照步驟(5)，調節前向角散射光檢測器的Z軸和Y軸，使光斑進入FSC針孔中央，調節Y軸和X軸使針孔中的亮斑至最亮、散點圖中信號最強以及CV值最小。

(7)液滴頻率優化。在100 μm的噴嘴和17.1 psi(0.118 MPa)的鞘液壓力條件下，在Sorting Settings窗口中輸入初始液滴的頻率值為36 kHz，觀察Drop顯示屏，調節監視器位置找到斷點后調節液滴頻率使斷點最高，若斷點超出顯示范圍可調節監視器的位置。

(8)振幅優化。合上電偏轉板，在Sort Layout窗口中Sort Mode選擇1.0 Drop Pure，在Sorting Settings窗口中點擊Test Streams，則可在Stream顯示屏中見到測試液流分叉。若液流分叉不可見或呈線狀閃動，可通過調節振幅使液流分叉呈穩定的亮點。若液流打在偏轉板上或不能通過廢液收集器，可調節Maximum Drop Charge值使液流分叉適宜。若在Test Streams條件下測試液流分叉正常，可再單擊Flash Charge，同以上過程優化振幅。

(9)液滴延遲優化。畫一個散點圖，橫坐標為FSC，縱坐標為SSC，右上方畫一個盡可能小的門，標為P1，在Gate Hierarchy中生成NOT P1門。同時閾值探測器選擇FSC，再將含有Accudrop beads的樣品上樣，調節流速穩定在每秒1000～3000個細胞，且P1門內盡可能無細胞。在Sort Layout窗口中Sort Device選擇Accudrop Setup，Sort Mode選擇1.0Drop Pure，分選門選擇NOT P1。將濾光片調至遮擋位置，并按下針孔顯示屏下方的紅色加壓按鈕，點擊Sort Layout窗口中的Sort Ready和Start，觀察Stream顯示屏，調節Sort Settings窗口中的Calculate值，使顯示屏中的亮點從右調至左，液滴延遲優化完成。

(10)細胞分選。確定收集管位置后開始細胞分選。

2 結果

2.1 針孔顯示屏中液流聚焦清楚

如圖1所示，液流位置在針孔中央且液流聚焦清楚即為最佳位置(圖1-A)，液流聚焦不清為調試不佳，無法正常分選(圖1-B)。

圖1 針孔顯示屏顯示液流聚焦圖

如圖2所示，液柱打入廢液收集管正中央，如圖2-A中箭頭所示，圓球狀亮點小且亮即為最佳位置；圖2-B為調適不佳，液柱偏左，無法正常分選。

圖2 Stream顯示屏顯示液柱打入廢液收集管

2.3 優化488 nm激光熒光通道

如圖3所示，圖3-A中光斑進入第1個針孔中央且光斑最亮即為最佳位置，圖3-B中光斑未進入針孔中央為調適不佳，無法正常分選。可調節488 nm激光的Z軸和噴嘴上方的銀色旋鈕Y軸使光斑進入針孔中央。

圖3 針孔顯示屏顯示優化熒光通道后信號圖

2.4 優化前向角散射光

如圖4所示，圖4-A中光斑進入FSC針孔中央且最亮即為最佳位置，圖4-B中光斑未進入針孔中央或未達到最亮，為調適不佳，需繼續調試。

圖4 針孔顯示屏顯示優化前向角散射光后信號圖

2.5 液滴頻率優化結果

如圖5所示，圖5-A中斷點最高的液滴頻率為最佳頻率，圖5-B中斷點非最高、最佳頻率。

圖5 優化液滴頻率后斷點位置圖

2.6 振幅優化

如圖6所示，圖6-A中液流分叉呈穩定的亮點即為最佳振幅。若液流分叉不可見或呈線狀閃動(圖6-B)，需繼續調節振幅。

圖6 振幅優化后液滴形狀圖

2.7 液滴延遲調試結果

如圖7所示，屏中的亮點從右方調到左方即完成液滴延遲優化。右側的亮點表示分選至廢液中drop delay不正確；左側的亮點表示分選至收集管中drop delay為正確。若顯示屏中仍存在兩個亮點，則液滴延遲未達到最佳狀態需繼續調節；若發現屏中的亮點連成一條線，需重新優化振幅使液流分叉呈穩定的亮點再調液滴延遲。如果屏中始終只有右方一個亮點，可能因為偏轉電壓過大使信號超出范圍，可減小Maximum Drop Charge值，再調節液滴延遲。

圖7 Stream顯示屏顯示液滴延遲優化后信號圖

2.8 CD4+T淋巴細胞亞群分選結果

如圖8所示，使用以上調試方法，經流式細胞儀分選后得到CD4+T淋巴細胞亞群分選結果，分選純度為99%、效率達到95%則說明儀器的分選參數調試正確，儀器分選處于最佳使用狀態。

圖8 CD4+T-PerCP-Cy5.5淋巴細胞亞群分選前后結果

3 討論

近年來，流式細胞術在分選如肝癌、卵巢癌、宮頸癌、胃癌和血液腫瘤等側群細胞中有著廣泛的應用[8-12]。同時在脂肪干細胞、血液腫瘤干細胞、頭頸部腫瘤干細胞及蠟樣芽胞桿菌等的分選中也發揮著重要的作用[13-15]。細胞的分選是通過分離含有單細胞的液滴來實現的。在流動室的噴口上安裝有超高頻電晶體，充電后可以振動將噴出的液流斷裂為均勻的液滴，這時待測定細胞就分散在這些液滴中間。將液滴充以不同的正負電荷后，當液滴流經偏轉板的高壓靜電場時向左或向右偏轉落入各自的收集容器之中，未充電的液滴落入中間的廢液容器中從而完成了細胞的分離[16]。對儀器參數進行精確的調試和設定以達到設備最佳的分選狀態是決定分選水平的重要環節。

實驗中發現，開啟液流后觀察Drop顯示屏，如果液流形狀不正常則說明可能管路中有氣泡或噴嘴不潔凈，可將液流斷開后重新排氣泡或超聲噴嘴，使液流形狀正常后再調試其他參數。當短時間關閉液流后重新開啟時，需重新微調儀器各參數方可繼續使用。在長時間未關閉液流情況下，使用前需重新優化振幅和液滴延遲后再進行分選。使用儀器時如斷點發生移動需重新優化振幅和液滴延遲后再繼續使用。斷點越向上移動則液滴延遲時間越向下調。如果分選過程中樣本吸空，未及時關閉上樣鍵則會造成吸入氣泡和液流不穩定，必要時需重新排氣泡、調試參數后再繼續分選。

流式細胞分選的成功不僅僅取決于流式細胞儀本身，還與熒光素的選擇、樣本的制備及分選模式的選擇等因素密切相關。選擇熒光素要盡量降低光譜疊加的可能，使用強熒光素標記的抗體去結合低表達的抗原，并盡量避免偶聯染料的降解，考慮其是否會影響結果；流式分析樣本固定后需嚴格依照說明書在短時間內完成檢測[17]；需要分選獲得活細胞的樣本在制備時不能加入固定液；使用Influx進行單細胞分選時應選擇1.0 drop single模式。先富集再分選可獲得更高的純度和回收率[18]。

綜上所述，本研究的參數調試和條件設定方法可快速、準確地調試BD Influx分選型流式細胞儀的各項參數，用于標準分選、微孔板分選等模式對免疫細胞、干細胞和重組蛋白陽性表達克隆進行篩選和富集。未來，BD Influx分選型流式細胞儀在臨床和科研領域的應用范圍會更加廣闊、深入，為人類對疾病的認識和治療提供有益的幫助和支持。

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Research on the setting of optimal conditions and adjustment of sorting parameters for BD Influx flow cytometer/

LIANG Hao-yue, YANG Wan-zhu, CHENG Xue-lian, et al// China Medical Equipment,2014,11(2):5-9.

Objective: To explore the optimal conditions and adjustment of sorting parameters for BD Influx flow cytometer. Methods: Using Rainbow Beads and Accudrop Beads as experimental materials, optimization of pinhole, stream, fluorescence channel, forward scatter signal, drop frequency, piezo amplitude and drop delay was conducted. Results: The optimal condition was as follows, using the 100 μm nozzle, the stream was centered on the pinholes and sharply focused, the stream was aimed at the drain, the brightest signal was in the center of the pinhole after optimizing the fluorescence channel, the brightest signal was in the center of the FSC pinhole after optimizing the forward scatter signal, the breakoff point was highest after adjusting the drop frequency, and the droplet shape remained constant. When the piezo amplitude was around 5.20±1.00 and the drop delay value was around 35.20±2.00, the adjustment efficiency achieved its optimal condition, with its purity at 99% and sorting efficiency at 95%. Conclusion: Rapid setting of optimal conditions and adjustment of sorting parameters for BD Influx flow cytometer guarantees the success of gathering cells of high purity and activity after cell sorting.

Flow cytometry; Cell sorting; Sorting parameters; Optimal conditions

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2014.02.002

1672-8270(2014)02-0005-05

R446

A

2013-11-18

國家自然科學基金(81001377)“倍半萜內酯類活性成分的分離、衍生化及抗白血病干細胞的活性研究”

①中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院 血液學研究所 實驗血液學國家重點實驗室 天津 300020

*通訊作者：jyuwang@sina.com

梁昊岳,男,(1987- ),本科學歷，技師。中國醫學科學院北京協和醫學院血液病醫院 血液學研究所 實驗血液學國家重點實驗室，從事流式細胞測試工作。