正交試驗優選馬尾松松針中總黃酮的閃式提取工藝

陳良勝

（河南省新縣人民醫院藥劑科，新縣465550）

正交試驗優選馬尾松松針中總黃酮的閃式提取工藝

陳良勝

（河南省新縣人民醫院藥劑科，新縣465550）

目的研究馬尾松中黃酮的閃式提取工藝并與黃酮乙醇回流法對照差別。方法以馬尾松提取液中黃酮的含量為指標，采用正交實驗設計，對馬尾松閃式提取法的影響因素分別進行考察，并在提取率、提取時間、溶劑用量等方面與文獻報道的乙醇回流法進行比較。結果閃式提取的最佳工藝是85%乙醇，料液比1∶12，提取時間3.0min；閃式提取黃酮的含量經UV測定高于乙醇回流提取法。結論閃式提取法操作簡便、高效節能、經濟方便省時、提取率高。

閃式提取；馬尾松；黃酮；正交試驗

馬尾松(Pinus massoniana)隸屬裸子植物門松屬植物，為常綠喬木，廣布于我國長江兩岸及其以南的廣大地區。垂直分布在長江下游為海拔700米以下，長江中游為1100～1200米以下，西部為1500～2000米以下廣大地區。近幾年我國有專家為心腦血管病患者提供了一種全新的保健選擇：用松針煮茶喝。松針的提取物富含天然水溶性生物黃酮濃縮物，是一種強抗氧化劑，能有效清除自由基。松針的主要活性物質為黃酮類、木脂素及其苷類。黃酮類化合物主要有槲皮素、雙氫槲皮素、山柰酚等；木脂素主要有異落葉松脂素等；木脂素苷主要有木脂素的糖苷，還有莽草酸、對羥基苯基-2-丁酮、香草酸、氫醌等物質[1-3]。我國藥典古籍中也有松針保健治病功效的諸多記載，李時珍的《本草綱目》中說松針“可入藥、療疾”，《神農本草經》中，將有助長壽的松針列為“上藥”。現在，在美國、法國、西班牙等國，松針及松樹的藥用更為廣泛[2-7]。因而提取分離松針中有效成分黃酮并加以開發應用，有著積極的意義。本文采取正交設計的辦法考察溶劑、時間、料液比等對松針黃酮提取影響，得出其最佳工藝參數[4-7]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料UV760CRT雙光束紫外可見分光光度計（日本島津）；松針采自長江三峽庫區鐵峰山；蕓香苷標準品（中國生物制品檢驗所.）；所用試劑均為分析純。

1.2 方法松針葉中黃酮類物質含量的測定方法：黃酮類物質提取和測定具體方法如下[1]：

1.3 標準回歸方程的建立精密稱取蕓香苷一定量，以60%乙醇溶解并稀釋成每毫升60μg的濃度。精密量取0.5～5.0ml不同量溶液，分別用60%乙醇稀釋至5ml，準確加入3ml 0.1mol.L-1AlCl3溶液和5ml 1mol.L-1醋酸鉀溶液，放置20分鐘，在UV760CRT雙光束紫外可見分光光度計415nm處測定吸收度并建立標準回歸方程為Y=-1.77+97.48X(r=0.9897)。

1.4 測定方法精密稱取經烘至恒重松針粉（60目）0.5g于100ml的三角瓶中加入5ml 60%乙醇，將三角瓶和內容物一起稱重（稱至0.1g），然后在90℃水浴中回流1小時，冷卻后再稱重，并補充溶劑至原重，經濾紙過濾后，取2.5ml濾液至試管中，并加入2.5ml蒸餾水稀釋至5ml精確加入3ml 0.1mol.L-1AlCl3和5ml mol. L-1醋酸鉀溶液，放置20分鐘，在UV760CRT雙光束紫外可見分光光度計415nm處測定吸收度，以同一濾液同樣量加水至13ml為對照，根據標準方程計算出黃酮含量。

表1 不同濃度蕓香苷溶液的吸收度

2 黃酮的提取分離

2.1 閃式提取法正交實驗本研究選取影響閃式提取工藝的三個因素，即乙醇濃度（A），料液比（B），提取時間（C）為考察因素，每個因素設計三個水平，選取L9（34）進行實驗，取松針藥材粗粉50g，根據因素水平表L9（34），進行閃式提取，過濾，濾液定溶至1000mL量瓶中，進行含量測定。實驗安排及結果見表1。

表2 因素水平表

表3 正交設計表及結果（mg/g）

由上表可知A2B2C3為閃式提取最佳工藝。

2.2 方差分析將實驗數據代入SPASS軟件中，進行方差分析，見表2。結果表明：A因素具有顯著差異，A2＞A3＞A1，故選擇A2；B因素B2＞B3＞B1，故選擇B2；C因素C3＞C2＞C1，BC因素均無顯著性差異，根據表2中含量測定的結果顯示，采用A3B2C3工藝條件，黃酮的含量最高，故定為最優工藝，即以12倍量75%乙醇，閃式提取3.0min。見表5，表6。

表4提取因素對提取率影響表

表5 方差分析表

2.3 驗證實驗為驗證優選工藝的可靠性和重現性，取松針粉150g，按最優工藝進行閃式提取，平行實驗5份，黃酮含量分別為3.42，3.86，4.01(mg/g)，表明該工藝穩定可行，可操作性和重復性強。見表3。

2.4 乙醇回流提取法松針粉一般采取采取加熱回流法提取黃酮，參照相關文獻方法提取松針黃酮。制備6批樣品，并按照前述“松針黃酮的含量測定”方法測定，計算平均結果與閃式提取的優化結果進行對比，見表4。

表6 閃式提取與加熱回流提取的比較

從表4得出，閃式提取法與乙醇加熱回流提取法相比，閃式提取乙醇濃度基本相同，提取時間僅為后者的1/70，且閃式提取法黃酮含量較高。

3 結果與討論

通過實驗得到了松針黃酮閃式提取的最優工藝條件，即75%的乙醇，料液比1∶12，閃式提取時間3min。該方法具有提取時間短、提取效率高、操作簡單、生產成本低等特點。與傳統提取方法相比，閃式提取時間僅為后者的1/70，且閃式提取法總黃酮含量較傳統方法為高。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.Flora of China(中國植物志)[M].Beijing: Science Press，1978.36-40.

[2]Yamauchi S，Sugahara T，Nakashima Y，et al.Radical and superoxide scavenging activities of matairesinol and oxidized matairesinol[J].Biosci Biotechnol Biochem，2006，70:1934-1940.

[3]Kim YS，Shin DH.Volatile components and antibacterial effects of pine needle (Pinus densiflora S.and Z.)extracts[J].Food Microbiology，2005，22(1):37-45.

[4]Shen ZB，Theander O.Flavonoid glycosides from needles of Pinus Massoniana[J]. Phytochemistry，1985，24(1):155-158.

[5]Bi RF(畢躍峰)，Zheng XH(鄭曉珂)，et al.Isolation and structure identification of lignan glycosides from pine needles of Pinus massoniana Lamb[J].Miq.Acta Pham Sin(藥學學報)，2002，37(8)：626-629.

[6]Bi RF(畢躍峰)，Zheng XH(鄭曉珂)，et al.Study on the chemical constituents of Masson Pine[J].Miq.Acta Pham Sin(藥學學報)，2001，36(11)：832-835.

[7]Feng WS(馮衛生)，Wang YZH(王彥志)，Zheng XH(鄭曉珂)，et al.Isolation and structure identification of the chemical constituents of the of Masson Pine[J]. Miq.Acta Pham Sin(藥學學報)，2004，39(3)：190-193.

Multi-Stage Flash Distillation Extraction of Flavoneand from Pinus Massoniana

Chen Liangsheng
(Xincounty people's hospital of Henan province,Xinyang465550,China)

Objective To study the multi-stage flash distillation extraction of Flavoneand from Pinus massoniana,and compared ethanol refluxing extraction of Flavoneand from Pinus massoniana.Methods The content of Flavoneand in extract of Pinus massoniana was taken as index,and orthogonal design was applied to observe the influence factors on multi-stage flash distillation extraction．Multi-stage flash distillation extraction was compared with ethanol refluxing extraction reported in literature in extraction rate,extraction time and ethanol consumption as factors．Results The optimized technique of homogenate extraction was as follows：85%ethanol in 12 times volume，homogenate extraction for 3 minutes,The homogenate extraction is slightly higher than that of ethanol reflux extraction.Conclusion Homogenate extraction is simple,high efficiency and energy saving,economical,high extraction rate.

multi-stage flash distillation extraction;P.massoniana;flavoneand;orthogonal test

10.3969/j.issn.1672-2779.2014.24.088

1672-2779（2014）-24-0155-02

蘇玲 本文校對：孫先元

2014-10-22）