HCCR mRNA在原發性肝細胞癌患者中的表達及臨床意義

張華，鐘白云，張秋煥

(1、益陽市中心醫院檢驗科，湖南益陽413000；2、中南大學湘雅醫院檢驗科，湖南長沙410008)

·論著·

HCCR mRNA在原發性肝細胞癌患者中的表達及臨床意義

張華1，鐘白云2，張秋煥2

(1、益陽市中心醫院檢驗科，湖南益陽413000；2、中南大學湘雅醫院檢驗科，湖南長沙410008)

目的探討人宮頸癌基因(human cervical cancer oncogene，HCCR)mRNA在原發性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma，PHC)患者中的表達及其臨床意義。方法采用RT-PCR檢測PHC癌組織、癌旁肝組織和肝硬化組織及各組外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中的HCCR mRNA表達水平，并進行分析。結果HCCR mRNA在PHC組織中的相對表達強度為0.83±0.10，癌旁肝組織中的相對表達強度為0.12±0.07，肝硬化組織中的相對表達強度為0.57±0.12，三組均數間兩兩比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。PBMC中，肝癌患者HCCR mRNA的表達強度為0.55±0.06，肝硬化患者HCCR mRNA的表達強度為0.34±0.04，而正常人未檢測出，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論PHC和肝硬化患者的組織和PBMC中HCCR表達明顯增高，HCCR基因可能參與了PHC的發生與發展，其與PHC的惡變演進有一定的相關性。

人宮頸癌基因；原發性肝細胞癌；肝硬化；mRNA

原發性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是常見的消化道腫瘤之一，其一般起病隱匿，早期癥狀不明顯，確診時多屬晚期，治療效果差，預后惡劣，因此開展早期檢測、診斷和治療，對PHC患者尤為重要[1]。有研究表明，由Ko J等用差異RT-PCR法從宮頸癌癌組織篩選得到的差異表達基因人宮頸癌基因(Human cervical cancer oncogene，HCCR)與PHC關系密切，可能在PHC早期發生中起“主導”作用[2，3]。筆者在本研究的前期工作中應用ELISA對HBV相關性肝臟疾病患者的血清HCCR水平進行檢測，發現HCCR隨著HBsAg的升高而升高。本研究應用逆轉錄PCR (RT-PCR)和瓊脂糖凝膠電泳分析組織和外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中HCCR的水平，旨在探討HCCR基因是否參與了肝細胞癌的發生與發展，及其與PHC的惡變演進是否有一定的相關性。

1 材料與方法

1.1 研究對象40份肝細胞癌標本來自益陽市中心醫院2013年1月至2014年3月住院病人手術切除標本，男24例,女16例,平均年齡43±12歲，均經病理檢查證實為原發性肝細胞癌(PHC)，所有標本手術前未經過放療、化療、微波刀、介入等針對腫瘤的任何治療，有手術前后完整的病案資料；每例病人分別取腫瘤組織和遠端癌旁組織(距腫瘤邊2～5cm，病理學證實為正常組織)，組織均凍于液氮備用。40例肝硬化標本來自肝穿刺活檢標本，經病理檢查證實為肝硬化，其中男22例，女18例，平均年齡40±15歲；對照組40例來自肝功能正常及其它肝炎病毒標志物均為陰性的本院健康體檢者。所有研究對象排除腦、肺、腎、胰等器官疾病及女性宮頸癌疾病。

1.2 主要試劑Trizol RNA提取試劑盒系AMV TaKaRa生物公司產品，Ficoll分離液、Hank’s液系上海研卉生物科技有限公司產品，Tris堿、逆轉錄酶(M-MLV)、5×定量PCR Buffer、dNTPs、引物、探針、TaqDNA聚合酶、5×逆轉錄Buffer、Rnase抑制劑購自北京達安基因股份有限公司，氯仿、異丙醇、溴化乙錠、二甲苯青FF、DEPC水、瓊脂糖購自國藥集團化學試劑有限公司，100bp DNA Marker購自百川開泰生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PBMC中提取總RNA采用Ficoll分離液得到其PBMC，-80℃超低溫冰箱凍存備用。然后參照Trizol RNA提取試劑盒說明書進行操作。

1.3.2 組織中RNA的提取將存于液氮中的組織取出50mg，迅速移于預冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，成粉末狀后，同樣參照Trizol RNA提取試劑盒說明書進行操作。最后用移液管加入DEPC水，使RNA完全溶解。

1.3.3 總RNA純度、濃度及完整性測定在200μl PCR管中加入1.0μl RNA原液，加DEPC水至100μl，移液槍反復吹打混勻。采用紫外分光光度計測定A260、A280值，計算A260/A280比值。比值≥1.8滿足要求。RNA原液濃度=A260×稀釋倍數×100(ng/ μl)。電泳檢測結果出現明顯的5S、18S和28S的三個條帶者視為RNA結構完整(圖1)，符合RT-PCR實驗要求。

圖1 RNA凝膠電泳(M:Marker)

1.3.4 引物設計、合成用軟件Premier5.0設計引物，HCCR序列如下，上游S1：5＇ACCCC^AAACAACAAACTG3＇；下游S2：5＇ATGGTTCATlll2AGCGCCTr-3＇，相應的RT-PCR產物大小為579bp。內參設為GAPDH：上游S1∶5＇-GGAGCGAGATCCCTCCAAAA-3＇；下游S2：5＇GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3＇，產物大小為197bp，引物由Invintrogen公司合成。

1.3.5 cDNA的合成25μl逆轉錄體系：根據A260算出RNA的濃度，取2.0μgRNA，隨機引物2.0μl，5×RT緩沖液4.0μl，10 U/μl Rnase抑制劑1.0μl，25 mmol/L Mg2+l.0μl，10mmol/L dNTP 2.0μl，100 U/μl M-MLV逆轉錄酶1.0μl，DEPC水補足體系，37℃水浴60 min，94℃滅活逆轉錄酶，4℃微離心，獲取的cDNA于-20℃保存備用。

1.3.6 逆轉錄-聚合酶鏈擴增反應(RT-PCR)反應體系為25μl，包括cDNA 1.0μl，Taq緩沖液2.5μl，10mmol/l dNTP1.0μl,25 mmol/L Mg2+1.5μl，2.5U/ μl Taq酶0.4μl，10μmol/L待測HCCR上、下游引物及GAPDH各1.0μl，用DEPC水補至25μl。反應條件：95℃預變性3min，然后95℃變性30s，60℃退火20s，72℃延伸30s，40次循環結束。每一樣本的檢測均做3個平行管以保證其結果的準確性。

1.3.7 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物取10μl PCR產物，加入2μl上樣緩沖液，混勻后加樣，同時滴加5μl DNA Marker，在80V電壓下電泳(根據示蹤劑溴酚藍的遷移距離)。在凝膠電泳成像系統(Image master VDS)下觀察、照相。

1.3.8 統計學處理采用SPSS16.0軟件進行數據分析，所有計量資料采用x±s表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝細胞癌組織、肝硬化組織和正常肝組織的HCCR基因表達的比較在凝膠電泳成像系統(Image master VDS)下拍照，通過Image master VDS分析軟件對照片進行去噪、增強等處理，利用已知濃度內參GAPDH進行定量分析，如圖2所示。分析各組的HCCR mRNA表達水平，比較三組HCCR mRNA表達水平，差異具有統計學意義(P＜0.05)。各組兩兩比較發現，肝細胞癌組織中的HCCR mRNA表達水平明顯高于肝硬化及癌旁肝組織(P＜0.05)，其增高次序為：癌旁肝組織＜肝硬化＜肝細胞癌，如表1所示。

2.2 PHC、肝硬化患者和正常人PBMC中HCCR基因表達的比較PHC與肝硬化患者PBMC的HCCR基因表達水平比較，差異有統計學意義(P= 0.00)，而正常人PBMC的HCCR mRNA無表達，三者相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)，如圖3，表2所示。

圖2 肝細胞癌組織、肝硬化組織和癌旁正常肝組織的HCCR mRNA的含量

表1 肝細胞癌、肝硬化和癌旁正常肝組織中HCCR mRNA的表達情況

圖3 肝細胞癌患者、肝硬化患者和正常人PBMC中HCCR mRNA的含量

表2 PHC、肝硬化患者和正常人PBMC中HCCR mRNA的表達情況

3 討論

人宮頸癌基因(human cervical cancer oncogene，HCCR)是近年發現的與人類多種腫瘤有關的基因，系由Ko J等用差異RT-PCR法從宮頸癌癌組織篩選得到的差異表達基因，其定位于人的染色體的12q，編碼HCCR-1和HCCR-2兩種單跨膜蛋白，分子量分別為42kDa和36kDa[2]。HCCR不僅在宮頸癌組織中表達，而且在許多其他腫瘤(如乳腺、腎、淋巴、胃、結腸、卵巢等)中也可見其呈過量表達，尤其在腫瘤早期就可檢測出HCCR過量表達[3]。

本研究結果顯示PHC患者的肝細胞癌組織中的HCCR mRNA的相對表達強度為0.83±0.10，而其對應的癌旁正常肝組織為0.12±0.07，肝硬化組織HCCR mRNA的相對表達強度為0.57±0.12，三者相比，差異具有統計學意義(F=539.34，P＜0.05)。其增高次序為：癌旁正常肝組織＜肝硬化＜肝細胞癌，隨著臨床表現逐步加重逐步升高(P＜0.05)。通過對瓊脂糖凝膠電泳結果進行分析，HCCR mRNA在PHC組織中的含量明顯高于肝硬化及遠端癌旁正常肝組織，提示HCCR可用于評價和監測從肝硬化到肝細胞癌的進展過程，HCCR的異常表達與PHC的發生、發展密切相關。有研究使用HCCR的反義核酸轉染肝細胞癌細胞系HepG2細胞，結果顯示HepG2細胞中的HCCR的表達受抑制，細胞停滯于G1期，通過抑制細胞的增殖從而促進細胞凋亡，提示癌基因HCCR可能在肝細胞癌的病變早期就開始起作用，與PHC的發生發展密切相關[4]。本研究結果與上述觀點一致。但HCCR異常表達參與PHC的發生發展機制有待進一步研究。目前認為HCCR參與PHC早期發生的機制可能有：(1)被稱為“基因組衛士”的腫瘤抑制基因p53，在機體組織細胞的生長、發育與分化等過程中起重要作用，p53編碼序列發生改變是人類腫瘤中普遍的基因改變[5,6]。p53基因是許多惡性腫瘤十分常見的共同基因損傷靶位，它的結構改變與表達異常可能是這些腫瘤發生的中心環節。研究發現包括pHC在內的人類惡性腫瘤中至少有50%發生了p53基因改變，失去了有功能的p53蛋白，野生型p53基因為抑癌基因，突變或其他原因導致其功能失活使p53基因失去抑癌基因作用，這是研究癌基因與抑癌基因相互作用導致腫瘤發生機制的熱點之一[7,8]。有研究發現HCCR是腫瘤抑制因子p53的調節因子，通過誘導p53翻譯后修飾，抑制泛素依賴性蛋白酶體途徑對p53的降解、引起p53轉錄物活性負性調節等機制使p53功能發生缺陷，從而抑制p53功能來促進癌變[9]。預示其可以作為PHC重要的早期診斷標記物以及基因治療的作用靶點，因此，深入研究HCCR在肝細胞癌早期診斷中的價值以及其生物學功能具有重要的臨床意義。(2)HCCR的致癌作用是通過磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途徑實現的，PI3K的過量表達能激活HCCR的啟動子，即PI3K/Akt途徑活化可以促進HCCR表達，HBV編碼HBx可以通過PI3K/Akt途徑上調HCCR的表達，傳遞細胞存活的信號，說明在PHC發生和發展過程中，HCCR和HBV可能起著協同作用[10-12]。HCCR在PHC組織中高表達，而在正常肝組織中低表達或不表達，故可以將HCCR作為診斷PHC的一種新的標志物，用于PHC的早期診斷。本研究還發現PHC患者外周血單個核細胞中HCCR mRNA水平高于肝硬化患者，而正常人外周血單個核細胞HCCR mRNA無表達，這意味著血清HCCR蛋白可作為PHC診斷及鑒別診斷的生物學標志物。現已制備了HCCR的多克隆抗體，建立了檢測血清HCCR水平的間接ELISA方法，發現PHC患者血清中HCCR水平顯著高于脂肪肝(非酒精性)、肝硬化、慢性活動性肝炎等患者，提示血液中HCCR mRNA的水平高低可能與肝病患者的病情發展有關，可用于診斷PHC，與本研究結果一致。

綜上所述，HCCR在肝細胞癌腫瘤組織PBMC中有較強表達，提示HCCR可能在PHC的發生發展中起重要作用，HCCR有望成為PHC病情發生、發展及預后評估的重要標志物，在診斷早期PHC及小肝細胞癌等方面具有很好的應用前景。

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Relationship between HCCR mRNA and primary hepatocellular carcinoma

ZHANG Hua,ZHONG Baiyun,ZHANG Qiuhuan.Department of Clinical Laboratory,the Central Hospital of Yiyang City,Yiyang Hunan 413000,China

Objective To detect the expression level of HCCR mRNA in primary hepatocellular carcinoma(PHC)and explore its clinical significance.Methods Reverse transcription polymerase chain reaction was used to detect the expression of HCCR mRNA in PHC tissues,surrounding non-tumor tissues,hepatocirrhosis tissues and peripheral blood mononuclear cells.Results The relative expression level of HCCR mRNA in PHC tissues was 0.83±0.10,and which in surrounding non-tumor tissues and the hepatocirrhosis tissues were 0.12±0.07 and 0.57±0.12,respectively.The differences in the three groups had statistical significance (P＜0.05).The relative mRNA level of HCCR in the PBMC of PHC patients were 0.55±0.06 and which in the hepatocirrhosis patients were 0.34±0.04,while HCCR expression in the normal ones could not detected.The differences had statistical significance (P＜0.05).Conclusion The mRNA levels of HCCR in PHC tissues,hepatocirrhosis tissues and their PBMC are up-regulated significantly,which suggests that HCCR maybe involved in the occurrence and development of PHC,and maybe related to the malignant change of PHC.

Human cervical cancer oncogene;Primary hepatocellular carcinoma;Hepatocirrhosis;mRNA

R735.7,R446.62

A

1674-1129(2014)06-0654-04DOI∶10.3969/j.issn.1674-1129.2014.06.002

2014-09-02；

2014-10-08)

湖南省自然科學基金項目(NO.12JJ3089)

張華，男，出生于1981年，碩士，主管檢驗師，主要從事分子生物和生物化學的實驗研究。